Name: Fluorescenza In situ (FISH) Protocollo di sperma umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Impara il protocollo FISH per l'analisi degli spermatozoi umani. Questo metodo consente lo screening dell'aneuploidia nei maschi infertili, analizzando i cromosomi 13, 18, 21, X e Y.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano a J. Blanco e F. Vidal per la loro supervisione e incoraggiamento, e J. Lucas per la sua assistenza tecnica.

I. Trattamento dei campioni e la fissazione delle cellule <ol><li> Lasciare il campione di seme in contenitori sterili a temperatura ambiente per 20 minuti fino a liquefazione. </li><li> Trasferire il campione in una provetta da centrifuga e spin è a 1000g per 5 minuti. </li><li> Rimuovere delicatamente e scartare il surnatante con una pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungi una soluzione ipotonica (KCl, 0.075M) pre-riscaldato a 37 ° C, goccia a goccia, mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 10 ml. </li><li> Porre il tubo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 1000g per 5 minuti. Eliminare attentamente il supernatante per decantazione, senza disturbare il pellet. </li><li> Dopo risospendere il pellet, aggiungere preparata Carnoy fissativo (3:1 metanolo: acido acetico) goccia a goccia mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 8 ml. </li><li> Ripetere i punti 6 e 7 come numero di volte necessario per ottenere una pallina bianca. </li><li> Aggiungere metanolo appena preparato: acido acetico (3:1) goccia a goccia per regolare il volume finale alla concentrazione cellulare necessarie per ottenere una buona diffusione delle cellule (nei casi con una piccola pallina, poche gocce sono sufficienti, mentre i campioni con una quantità elevata di spermatozoi recuperati, il volume finale può raggiungere 1-2 ml). Una diapositiva di prova può essere fatta facendo cadere il campione risospeso su uno scivolo ungreased ed esaminando al microscopio a contrasto di fase. Questo permetterà di controllare la dispersione cellulari ottenute e che permettono di correggere, se è necessario, in altre diapositive. </li><li> Per rendere le estensioni, caduta da una altezza minima di 40 cm due o tre gocce di sospensione cellulare al centro di diapositive unfrosted (precedentemente memorizzati in metanolo a -20 ° C a sgrassare loro). Per abilitare la posizione del campione in tutto il protocollo, segnare l&#39;area contenente l&#39;estensione sperma sul lato opposto della diapositiva con una matita diamante. </li><li> Conservare i campioni a -20 ° C per almeno 24 ore. Nota: L&#39;aggiunta del metanolo: acido acetico (3:1) goccia a goccia sotto agitazione è un passo molto importante per evitare la formazione di aggregati sperma. </li></ol> II. Decondensazione <ol><li> I vetrini conservati a -20 ° C deve essere scongelato per proseguire con il protocollo (lasciarli a temperatura ambiente). </li><li> Mettere il vetrino in due vaschette Coplin consecutivi con 2x salina-la soluzione di sodio citrato (2xSSC) per 3 minuti ciascuno. </li><li> Trasferire i vetrini attraverso una serie di lavaggi etanolo per 2 minuti in ogni vaschetta Coplin. Inizia con etanolo al 70%, seguite dal 90% e finire con il 100%. Asciugare il vetrino lasciandola a temperatura ambiente. </li><li> Incubare il vetrino in una soluzione ditiotreitolo (1,4-ditiotreitolo 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(idrossimetil) -1,3-propandiolo 50mm) a 37 ° C in incubatore a decondense della cromatina. Questo prodotto agisce rompendo i ponti disolfuro della protamine bobina che il DNA nel nucleo degli spermatozoi. Questo è un passo molto importante perché il DNA nel nucleo degli spermatozoi è molto compatta. Il tempo di incubazione delle diapositive in soluzione ditiotreitolo (DTT) deve essere regolata in base alla reattività del campione di questo prodotto. Di solito, questa volta è di circa 8 minuti, anche se può variare da 2 a 15 minuti. </li><li> Immediatamente, il trasferimento lo scivolo a due vasetti consecutivi Coplin con 2xSSC per 3 minuti in ogni Coplin. </li><li> Continuare mettendo la diapositiva con una serie di lavaggi etanolo per 2 minuti in ogni barattolo Coplin (70%, 90% e il 100% di etanolo). Lasciate che il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente. Nota: l&#39;esposizione eccessiva al digitale terrestre porterebbe a disperdere i segnali FISH al termine della procedura, mentre una esposizione troppo breve si tradurrebbe in una mancanza di alcuni segnali. </li></ol> III. Ibridazione <ol><li> Denaturare il DNA dello sperma incubando il vetrino in una vaschetta Coplin con la soluzione formammide (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C per 5 minuti. </li><li> Trasferire il vetrino attraverso soluzioni di etanolo per 1 minuto per Coplin vaso (inizio con il 70% di etanolo, 85% e finire con il 100%). Lasciare il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere direttamente 5 l del corrispondente pronti per l&#39;uso miscela sonda di una scivolata copertura 15x15 (Assay AneuVysion multi-colore del pannello della sonda: CEP 18/X/Y o LSI 13/21). </li><li> Come è mostrato nel video, posizionare con attenzione il vetrino sul vetrino di mettere insieme la regione di destinazione e la miscela della sonda. Sigillarlo con mastice. </li><li> Mettere il vetrino in una pre-riscaldato a 37 ° C camera di ibridazione (HYBrite ™) e incubare è a 37 ° C per 6-24 ore. Nota: considerando che la denaturazione del campione di sperma è obbligatoria, la necessità di denaturazione delle sonde è determinato dal produttore. Le miscele di sonda utilizzata in questo protocollo sono pronti all&#39;uso e, in questo caso, denaturazione della sonda non è necessaria. Il volume della miscela sonda varierà a seconda delle dimensioni dell&#39;area ibridato. </li></ol> IV. Lavapost-ibridazione <ol><li> Estrarre il vetrino dalla camera di ibridazione. </li><li> Rimuovere il mastice ed estrarre delicatamente la polizza di copertura scorrevole leggermente di lato. </li><li> Per eliminare i segnali di ibridazione aspecifica posto il vetrino per 2 minuti in una vaschetta Coplin con 0.4xSSC/0.3% NP-40 pre-riscaldato a 73 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Trasferire i vetrini in una soluzione 2xSSC/0.1% NP-40 lavare a temperatura ambiente per 1 minuto. Lasciate che il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere un prodotto di contrasto alla regione bersaglio (8 litri per una copertura antiscivolo 18x18). Il prodotto più comune utilizzato è 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Vysis Inc.). </li><li> Come è mostrato nel video, la regione delle ibridato con un vetrino (per preservare l&#39;ibridazione la polizza di copertura può essere sigillato con smalto). </li><li> Conservare i vetrini ibridato a -20 ° C al buio fino a quando la loro analisi prospettiva. In queste condizioni le diapositive possono essere conservati per un massimo di 12 mesi senza perdita significativa dell&#39;intensità del segnale di fluorescenza. Nota: Una temperatura più alta o un tempo di lavaggio eccessive può provocare l&#39;eliminazione di alcuni segnali, mentre il contrario non sarebbe lavare ibridazioni sonda aspecifici. Il volume del prodotto di contrasto aggiunto varierà a seconda delle dimensioni dell&#39;area di ibridazione di coprire. </li></ol> V. visualizzazione La preparazione può essere valutato sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una tripla banda filtro per DAPI / Texas Red / FITC e single-band filtri per Aqua, FITC e Texas Red. Criteri di valutazione standard devono essere seguite per la corretta valutazione dei nuclei dello sperma 1. La preparazione ibridato con sonde per i cromosomi X, Y e 18 dovrebbe mostrare segnali per questi tre cromosomi. Ogni spermatozoi normali devono mostrare un segnale blu (corrispondente al cromosoma 18), e un segnale verde (X-cuscinetto spermatozoi) o di un segnale rosso (Y-cuscinetto spermatozoi). Nella preparazione ibridato con sonde per i cromosomi 13 e 21, un segnale verde per il cromosoma 13 e un segnale rosso per cromosoma 21 dovrebbero essere distinti in ogni spermatozoi normali.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Questo protocollo descrive come trattare i campioni di sperma umano per ottenere preparazioni FISH spermatozoi. Utilizzando questo protocollo è possibile analizzare le anomalie cromosomiche nei gameti maschili. Spermatozoi di screening aneuploidia ha applicazioni sia nel contesto della ricerca di base e nei consigli riproduttiva dato ai maschi infertili. Anche se nella diagnosi clinica dei cromosomi più studiati sono X, Y, 13, 18 e 21, altre sonde commerciali per una vasta gamma di cromosomi e loci sono disponibili e po...

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Materiale</td><td>Gruppo Roche</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propanediolo</td><td>Materiale</td><td>Gruppo Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Materiale</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Kit per sonde DNA multicolore&lt;ul style=&quot;padding:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Saline-Sodium Citrate&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;sonda di DNA CEP 18/X/Y&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;sonda di DNA LSI 13/21&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Materiale</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;padding:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5804R</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga</td><td>Materiale</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>barattolo Coplin (in vetro)</td><td>Materiale</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>barattolo Coplin (in plastica)</td><td>Materiale</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (15x15)</td><td>Materiale</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (18x18)</td><td>Materiale</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Matita diamantata</td><td>Materiale</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Materiale</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formammide</td><td>Materiale</td><td>Gruppo Roche</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore</td><td>Strumento</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Materiale</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Strumento</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio per immersione</td><td>Materiale</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Strumento</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Materiale</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>Materiale</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Punta di ricambio per micropipetta</td><td>Materiale</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Materiale</td><td>Quo-cosmetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescenza Olympus BX60</td><td>Strumento</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Dotato di un filtro a tre bande per DAPI/Texas Red/FITC e filtri a banda singola per Aqua, FITC e Texas Red.</td></tr><tr><td>Pipetta di Pasteur</td><td>Materiale</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Strumento</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di plastica (3 ml)</td><td>Materiale</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Materiale</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Colla di gomma</td><td>Materiale</td><td>Miglior test</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Materiale</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Scatole salva-vetrini</td><td>Materiale</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore sterile</td><td>Materiale</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Materiale</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Materiale</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Acqua tri-distillata</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Materiale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Materiale</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Flusso laminare verticale &lt;em&gt;cappa a flusso laminare&lt;/em&gt;</td><td>Strumento</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore vortice</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a bagno maria</td><td>Strumento</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescenza in situ</emibridazione> (fish) protocollo di sperma umano

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidie sono le più frequenti anomalie cromosomiche negli esseri umani. La maggior parte di queste anomalie derivare da errori durante il processo meiotico gametogenic nei genitori. Nei maschi umani, questi errori possono portare alla produzione di spermatozoi con anomalie cromosomiche numeriche che rappresentano un aumento del rischio di trasmissione di queste anomalie alla prole. Per questo motivo, la tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei degli spermatozoi è diventato un protocollo ampiamente adottato nel contesto della diagnosi clinica. Questa pratica fornisce una stima della frequenza di anomalie cromosomiche numeriche nei gameti dei pazienti che cercano di consulenza genetica riproduttiva. Ad oggi, i cromosomi più frequentemente inclusi nell&#39;analisi dello sperma FISH sono cromosomi X, Y, 13, 18 e 21. Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare e fissare un campione di sperma umano, come decondense e denaturare la cromatina spermatica, come procedere per ottenere preparazioni FISH spermatozoi, e come visualizzare i risultati al microscopio. Note particolari delle operazioni più rilevanti sono dati per ottenere i migliori risultati.

Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di fluorescenza<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; sugli spermatozoi umani. Le preparazioni ottenute possono essere utilizzate per lo screening aneuploidia nel contesto della diagnosi clinica.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Le aneuploidie sono le anomalie cromosomiche più frequenti nell'uomo. La maggior parte di queste anomalie deriva da errori meiotici durante la gametogenesi...

Il protocollo di ibridazione fluorescente in situ nei nuclei degli spermatozoi umani è stato ampiamente integrato nel campo della diagnosi clinica. Una delle applicazioni di questa metodologia è lo screening della ploidia degli spermatozoi. Nel contesto dei consigli sulla riproduzione forniti a soggetti maschi infertili, la presenza di anomalie numeriche è più elevata in questi individui rispetto alla popolazione generale, e spesso presentano parametri seminali anomali.Questo rappresenta un rischio aumentato di trasmettere queste anomalie a eventuali prole. Oggi illustreremo il protocollo di ibridazione fluorescente in situ su nuclei spermatici decondensati per l'analisi dei cromosomi 13, 18, 21, X e Y. Una volta raccolto il campione, deve essere lasciato a temperatura ambiente per 20 minuti fino al verificarsi della liquefazione. Per iniziare il protocollo, il campione deve essere trasferito in una provetta per centrifuga.Le soluzioni che utilizzeremo nella prima parte dell'esperimento sono ipertoniche, preriscaldate a 37 gradi C, e acido acetico in metanolo nella proporzione di tre a uno. Queste devono essere preparate al momento. Successivamente, il campione è pronto per essere centrifugato a mille G per cinque minuti.Ora, rimuovere delicatamente il soprannatante e aggiungere la soluzione ipertonica goccia a goccia fino a raggiungere un volume di circa 10 millilitri. Questo tubo deve rimanere a 37 gradi C per 30 minuti, dopodiché il campione deve essere centrifugato nuovamente. La centrifugazione fa sì che gli spermatozoi si accumulino sul fondo del tubo, permettendoci di sostituire la soluzione ipotonica con il metanolo.La centrifugazione con acido acetico deve essere ripetuta per sostituire il metanolo con acido acetico tante volte quante necessarie per ottenere un pellet bianco. Quando ciò avviene, deve essere aggiunto altro metanolo con acido acetico. Il volume finale deve essere regolato in base alla dispersione cellulare che si desidera ottenere nei successivi allungamenti.L'ultimo passaggio consiste nel realizzare le estensioni depositando il campione fissato su vetrini Reed conservati in metanolo a meno 20 gradi C. È utile delimitare l'area del vetrino contenente l'estensione spermatica per future localizzazioni. Questo può essere facilmente fatto utilizzando una matita a punta di diamante sul lato opposto del vetrino. Una volta verificata una dispersione cellulare ottimale, i vetrini devono essere conservati a meno 20 gradi C per un minimo di 24 ore.Prima di procedere con il protocollo. In questa parte dell'esperimento, utilizzeremo una serie di etanolo soluzione di citrato di sodio salina DRE fatale e fide. Dopo lo scongelamento dei vetrini, i campioni fissati devono essere lavati e disidratati immergendoli in due barattoli coplan consecutivi contenenti due volte SSC.Questa operazione richiederà tre minuti per ogni coplan. Successivamente, i vetrini devono essere immersi per due minuti in ciascun barattolo di etanolo coplan in ordine di concentrazione crescente. A questo punto, per proseguire con le fasi successive, i vetrini devono essere asciugati completamente.Dato che il DNA nel nucleo dello spermatozoo è altamente compattato, è necessario decondensare la cromatina prima di denaturarlo. Questo può essere fatto utilizzando una soluzione di DTT a 37 gradi C. Questo prodotto agisce rompendo i ponti disolfuro della protamina che avvolge il DNA nel nucleo dello spermatozoo. Il tempo di incubazione del vetrino nel DTT deve essere regolato in base alla reattività del campione di sperma a questo prodotto.Di solito questo tempo è di circa otto minuti, anche se può variare da due a quindici minuti; trascorso questo periodo, i vetrini devono essere trasferiti immediatamente in SSC 2× per tre minuti e nuovamente per altri tre minuti, seguiti da due minuti in ciascun barattolo di etanolo. Per l'ibridazione della sonda, è essenziale lavorare con filamenti singoli di DNA. Questo richiede una fase di denaturazione prima dell'aggiunta delle sonde, che prevede un periodo di incubazione di cinque minuti in una soluzione di formammide a 73 gradi C. Per concludere il trattamento dei vetrini, è necessario un ultimo trasferimento nella soluzione di etanolo, immergendo i vetrini per un minuto per ogni barattolo di etanolo.I vetrini sono quindi pronti per essere ibridati negli studi FISH effettuati per la diagnosi clinica. I cromosomi analizzati più frequentemente includono i cromosomi sessuali e i cromosomi 13, 18 e 21. Per analizzare questi cromosomi, utilizzeremo un kit multicolore di sonde DNA da vices.Questo contiene un vial con una combinazione di sonde per la regione satellitare alpha dei cromosomi X, Y e 18, marcati rispettivamente in verde e in azzurro, e un altro vial con una combinazione di sonde per i cromosomi 13 e 21, marcati rispettivamente in verde e arancione. Il volume della miscela di sonde aggiunta varierà in base alle dimensioni dell'area che si desidera ibridare, facendo riferimento a un'area di 15 per 15 coprioggetti. Un volume di cinque microlitri è sufficiente.Entrambe le miscele di sonde vengono pre-denaturate in un buffer di ibridazione per un uso immediato, pertanto possono essere aggiunte direttamente ai vetrini decondensati e denaturati. Sono inoltre disponibili altre sonde commerciali per un'ampia gamma di cromosomi e Loki che possono essere utilizzate in questi esperimenti. Di solito, tuttavia, queste sonde richiedono un trattamento di pre-denaturazione prima dell'aggiunta della miscela al campione bersaglio.In queste situazioni, è sufficiente seguire le istruzioni del produttore. La regione bersaglio deve essere coperta con un coverslip e sigillata con cemento di gomma. Successivamente, i vetrini sono pronti per essere posizionati nella camera di ibridazione, preriscaldata a 37 gradi C, e incubati a tale temperatura per sei-ventiquattro ore.Nell'ultima parte del protocollo, utilizzeremo queste due soluzioni di lavaggio composte da diverse concentrazioni di soluzione di citrato di sodio salino e dal detergente NP 40. Trascorso il tempo di incubazione, le preparazioni possono essere rimosse dalla camera di ibridazione per eliminare il cemento di gomma. Successivamente, si rimuove con attenzione il coverslip.Come mostrato, i vetrini vengono immersi per due minuti nella prima soluzione di lavaggio, preriscaldata a 73 gradi C. Successivamente vengono trasferiti nella seconda soluzione di lavaggio a temperatura ambiente per un ulteriore minuto. Questi due lavaggi ci aiuteranno a eliminare eventuali segnali di ibridazione non specifici. Dopo questi due lavaggi, dobbiamo attendere che i vetrini si asciughino per completare l'ultimo passaggio del protocollo.A questo punto, viene aggiunto un prodotto per la colorazione di contrasto per facilitare la visualizzazione del nucleo delle cellule. Uno dei prodotti più comuni utilizzati a questo scopo è dpi. Il volume aggiunto deve essere anch'esso adattato rispetto alla dimensione dell'area ibridata, prendendo come riferimento un'area di copertura di 18 per 18.Un volume di otto microlitri di DPI è sufficiente. Il vetrino coprioggetto può essere sigillato con smalto per unghie e ora i preparati sono pronti per essere visualizzati. In alternativa, possono essere conservati a meno 20 gradi C fino alla successiva analisi.Il microscopio che utilizzeremo per la visualizzazione è un Olympus BX 60 epifluorescente dotato di un filtro a tre bande per dpi, Texas Red, FITC e filtri a banda singola per aqua FITC e Texas Red. Attraverso il filtro a tre bande, la preparazione ibridata con x, Y e 18 mostra segnali per questi tre cromosomi. Utilizzando il filtro a banda singola per aqua, possiamo visualizzare esclusivamente i segnali fluorescenti per il cromosoma 18. Dovremmo aspettarci uno di questi segnali in ogni spermatozoo normale.Tuttavia, quando si utilizza il filtro a banda singola solo per FITC, alcuni spermatozoi mostrano un segnale fluorescente verde corrispondente al cromosoma X. Gli spermatozoi che non presentano il segnale verde dovrebbero mostrare un segnale rosso per il cromosoma Y, che può essere specificamente visualizzato attraverso il filtro per Texas red. Visualizzando l'ibridazione 1321 attraverso il filtro a tre bande, è possibile distinguere i segnali per questi due cromosomi.Il segnale verde corrisponde al cromosoma 13 e può essere visualizzato specificamente utilizzando il filtro a banda singola per FITC. Il filtro a banda singola per Texas Red ci permette di visualizzare specificamente i segnali per il cromosoma 21. Tutti gli spermatozoi normali dovrebbero mostrare un segnale per ciascuna di queste due sonde.Per riassumere, queste sono le fasi principali del protocollo. Ancora una volta, il processo di fissazione deve essere eseguito con precisione per ottenere allargamenti di buona qualità, aggiungendo goccia a goccia l'acido acetico metanolico. Per evitare la formazione di aggregati spermatici durante il processo di decondensazione, il tempo di incubazione nella soluzione di DTT deve essere regolato in base alla reattività del campione seminale a questo prodotto.Un'esposizione eccessiva degli spermatozoi al DTT provocherebbe segnali dispersi al termine del protocollo, mentre un'esposizione insufficiente determinerebbe un'assenza di ibridazione della sonda e la mancanza di alcuni segnali. Mentre la denaturazione del campione spermatico è obbligatoria, la denaturazione della sonda deve essere adattata alle indicazioni del produttore. È fondamentale mantenere un rigoroso controllo sul tempo e sulla temperatura dei due lavaggi successivi all'ibridazione.Una temperatura più elevata o un tempo di lavaggio eccessivo possono portare all'eliminazione di alcuni segnali, mentre il contrario non eliminerebbe i segnali non specifici. Infine, l'uso di un microscopio a fluorescenza episcopica dotato di filtri specifici adeguati è essenziale per una buona visualizzazione e interpretazione dei segnali. E questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Impara il protocollo FISH per l'analisi degli spermatozoi umani. Questo metodo consente lo screening dell'aneuploidia nei maschi infertili, analizzando i cromosomi 13, 18, 21, X e Y.

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