Fluorescenza In situ (FISH) Protocollo di sperma umano

Il protocollo di ibridazione fluorescente in situ nei nuclei degli spermatozoi umani è stato ampiamente integrato nel campo della diagnosi clinica. Una delle applicazioni di questa metodologia è lo screening della ploidia degli spermatozoi. Nel contesto dei consigli sulla riproduzione forniti a soggetti maschi infertili, la presenza di anomalie numeriche è più elevata in questi individui rispetto alla popolazione generale, e spesso presentano parametri seminali anomali.

Questo rappresenta un rischio aumentato di trasmettere queste anomalie a eventuali prole. Oggi illustreremo il protocollo di ibridazione fluorescente in situ su nuclei spermatici decondensati per l'analisi dei cromosomi 13, 18, 21, X e Y. Una volta raccolto il campione, deve essere lasciato a temperatura ambiente per 20 minuti fino al verificarsi della liquefazione. Per iniziare il protocollo, il campione deve essere trasferito in una provetta per centrifuga.

Le soluzioni che utilizzeremo nella prima parte dell'esperimento sono ipertoniche, preriscaldate a 37 gradi C, e acido acetico in metanolo nella proporzione di tre a uno. Queste devono essere preparate al momento. Successivamente, il campione è pronto per essere centrifugato a mille G per cinque minuti.

Ora, rimuovere delicatamente il soprannatante e aggiungere la soluzione ipertonica goccia a goccia fino a raggiungere un volume di circa 10 millilitri. Questo tubo deve rimanere a 37 gradi C per 30 minuti, dopodiché il campione deve essere centrifugato nuovamente. La centrifugazione fa sì che gli spermatozoi si accumulino sul fondo del tubo, permettendoci di sostituire la soluzione ipotonica con il metanolo.

La centrifugazione con acido acetico deve essere ripetuta per sostituire il metanolo con acido acetico tante volte quante necessarie per ottenere un pellet bianco. Quando ciò avviene, deve essere aggiunto altro metanolo con acido acetico. Il volume finale deve essere regolato in base alla dispersione cellulare che si desidera ottenere nei successivi allungamenti.

L'ultimo passaggio consiste nel realizzare le estensioni depositando il campione fissato su vetrini Reed conservati in metanolo a meno 20 gradi C. È utile delimitare l'area del vetrino contenente l'estensione spermatica per future localizzazioni. Questo può essere facilmente fatto utilizzando una matita a punta di diamante sul lato opposto del vetrino. Una volta verificata una dispersione cellulare ottimale, i vetrini devono essere conservati a meno 20 gradi C per un minimo di 24 ore.

Prima di procedere con il protocollo. In questa parte dell'esperimento, utilizzeremo una serie di etanolo soluzione di citrato di sodio salina DRE fatale e fide. Dopo lo scongelamento dei vetrini, i campioni fissati devono essere lavati e disidratati immergendoli in due barattoli coplan consecutivi contenenti due volte SSC.

Questa operazione richiederà tre minuti per ogni coplan. Successivamente, i vetrini devono essere immersi per due minuti in ciascun barattolo di etanolo coplan in ordine di concentrazione crescente. A questo punto, per proseguire con le fasi successive, i vetrini devono essere asciugati completamente.

Dato che il DNA nel nucleo dello spermatozoo è altamente compattato, è necessario decondensare la cromatina prima di denaturarlo. Questo può essere fatto utilizzando una soluzione di DTT a 37 gradi C. Questo prodotto agisce rompendo i ponti disolfuro della protamina che avvolge il DNA nel nucleo dello spermatozoo. Il tempo di incubazione del vetrino nel DTT deve essere regolato in base alla reattività del campione di sperma a questo prodotto.

Di solito questo tempo è di circa otto minuti, anche se può variare da due a quindici minuti; trascorso questo periodo, i vetrini devono essere trasferiti immediatamente in SSC 2× per tre minuti e nuovamente per altri tre minuti, seguiti da due minuti in ciascun barattolo di etanolo. Per l'ibridazione della sonda, è essenziale lavorare con filamenti singoli di DNA. Questo richiede una fase di denaturazione prima dell'aggiunta delle sonde, che prevede un periodo di incubazione di cinque minuti in una soluzione di formammide a 73 gradi C. Per concludere il trattamento dei vetrini, è necessario un ultimo trasferimento nella soluzione di etanolo, immergendo i vetrini per un minuto per ogni barattolo di etanolo.

I vetrini sono quindi pronti per essere ibridati negli studi FISH effettuati per la diagnosi clinica. I cromosomi analizzati più frequentemente includono i cromosomi sessuali e i cromosomi 13, 18 e 21. Per analizzare questi cromosomi, utilizzeremo un kit multicolore di sonde DNA da vices.

Questo contiene un vial con una combinazione di sonde per la regione satellitare alpha dei cromosomi X, Y e 18, marcati rispettivamente in verde e in azzurro, e un altro vial con una combinazione di sonde per i cromosomi 13 e 21, marcati rispettivamente in verde e arancione. Il volume della miscela di sonde aggiunta varierà in base alle dimensioni dell'area che si desidera ibridare, facendo riferimento a un'area di 15 per 15 coprioggetti. Un volume di cinque microlitri è sufficiente.

Entrambe le miscele di sonde vengono pre-denaturate in un buffer di ibridazione per un uso immediato, pertanto possono essere aggiunte direttamente ai vetrini decondensati e denaturati. Sono inoltre disponibili altre sonde commerciali per un'ampia gamma di cromosomi e Loki che possono essere utilizzate in questi esperimenti. Di solito, tuttavia, queste sonde richiedono un trattamento di pre-denaturazione prima dell'aggiunta della miscela al campione bersaglio.

In queste situazioni, è sufficiente seguire le istruzioni del produttore. La regione bersaglio deve essere coperta con un coverslip e sigillata con cemento di gomma. Successivamente, i vetrini sono pronti per essere posizionati nella camera di ibridazione, preriscaldata a 37 gradi C, e incubati a tale temperatura per sei-ventiquattro ore.

Nell'ultima parte del protocollo, utilizzeremo queste due soluzioni di lavaggio composte da diverse concentrazioni di soluzione di citrato di sodio salino e dal detergente NP 40. Trascorso il tempo di incubazione, le preparazioni possono essere rimosse dalla camera di ibridazione per eliminare il cemento di gomma. Successivamente, si rimuove con attenzione il coverslip.

Come mostrato, i vetrini vengono immersi per due minuti nella prima soluzione di lavaggio, preriscaldata a 73 gradi C. Successivamente vengono trasferiti nella seconda soluzione di lavaggio a temperatura ambiente per un ulteriore minuto. Questi due lavaggi ci aiuteranno a eliminare eventuali segnali di ibridazione non specifici. Dopo questi due lavaggi, dobbiamo attendere che i vetrini si asciughino per completare l'ultimo passaggio del protocollo.

A questo punto, viene aggiunto un prodotto per la colorazione di contrasto per facilitare la visualizzazione del nucleo delle cellule. Uno dei prodotti più comuni utilizzati a questo scopo è dpi. Il volume aggiunto deve essere anch'esso adattato rispetto alla dimensione dell'area ibridata, prendendo come riferimento un'area di copertura di 18 per 18.

Un volume di otto microlitri di DPI è sufficiente. Il vetrino coprioggetto può essere sigillato con smalto per unghie e ora i preparati sono pronti per essere visualizzati. In alternativa, possono essere conservati a meno 20 gradi C fino alla successiva analisi.

Il microscopio che utilizzeremo per la visualizzazione è un Olympus BX 60 epifluorescente dotato di un filtro a tre bande per dpi, Texas Red, FITC e filtri a banda singola per aqua FITC e Texas Red. Attraverso il filtro a tre bande, la preparazione ibridata con x, Y e 18 mostra segnali per questi tre cromosomi. Utilizzando il filtro a banda singola per aqua, possiamo visualizzare esclusivamente i segnali fluorescenti per il cromosoma 18. Dovremmo aspettarci uno di questi segnali in ogni spermatozoo normale.

Tuttavia, quando si utilizza il filtro a banda singola solo per FITC, alcuni spermatozoi mostrano un segnale fluorescente verde corrispondente al cromosoma X. Gli spermatozoi che non presentano il segnale verde dovrebbero mostrare un segnale rosso per il cromosoma Y, che può essere specificamente visualizzato attraverso il filtro per Texas red. Visualizzando l'ibridazione 1321 attraverso il filtro a tre bande, è possibile distinguere i segnali per questi due cromosomi.

Il segnale verde corrisponde al cromosoma 13 e può essere visualizzato specificamente utilizzando il filtro a banda singola per FITC. Il filtro a banda singola per Texas Red ci permette di visualizzare specificamente i segnali per il cromosoma 21. Tutti gli spermatozoi normali dovrebbero mostrare un segnale per ciascuna di queste due sonde.

Per riassumere, queste sono le fasi principali del protocollo. Ancora una volta, il processo di fissazione deve essere eseguito con precisione per ottenere allargamenti di buona qualità, aggiungendo goccia a goccia l'acido acetico metanolico. Per evitare la formazione di aggregati spermatici durante il processo di decondensazione, il tempo di incubazione nella soluzione di DTT deve essere regolato in base alla reattività del campione seminale a questo prodotto.

Un'esposizione eccessiva degli spermatozoi al DTT provocherebbe segnali dispersi al termine del protocollo, mentre un'esposizione insufficiente determinerebbe un'assenza di ibridazione della sonda e la mancanza di alcuni segnali. Mentre la denaturazione del campione spermatico è obbligatoria, la denaturazione della sonda deve essere adattata alle indicazioni del produttore. È fondamentale mantenere un rigoroso controllo sul tempo e sulla temperatura dei due lavaggi successivi all'ibridazione.

Una temperatura più elevata o un tempo di lavaggio eccessivo possono portare all'eliminazione di alcuni segnali, mentre il contrario non eliminerebbe i segnali non specifici. Infine, l'uso di un microscopio a fluorescenza episcopica dotato di filtri specifici adeguati è essenziale per una buona visualizzazione e interpretazione dei segnali. E questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.