Name: Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Impara a purificare oocisti di Toxoplasma gondii con un gradiente discontinuo di cloruro di cesio. Questo metodo consente di ottenere campioni ad alta purezza per esperimenti di biologia molecolare e colture cellulari.

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Vorremmo ringraziare Nichole Brinkman e Michael Ware per la revisione tecnica del manoscritto e il dottor Abu Sayed e Linda Ransick per il supporto tecnico e amministrativo. La United States Environmental Protection Agency attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo in parte finanziato e collaborato alla ricerca descritta qui il numero del contratto EP-D-06-096 a Dynamac, Inc. e un numero di contratto tra agenzie DW-12-92289801-0 a USDA. E &#39;stato sottoposto a revisione dall&#39;Agenzia e approvato per la pubblicazione. La citazione di nomi commerciali o di prodotti commerciali non costituisce approvazione o la raccomandazione per l&#39;uso. MJS attuale indirizzo: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. Precauzioni generali di sicurezza quando si lavora con<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti</p&gt;<ol&gt;<li&gt; E &#39;importante seguire tutte le precauzioni di sicurezza quando si lavora con<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti. Nella maggior parte degli individui sani,<em&gt; T. gondii</emInfezione&gt; è facilmente controllato dal sistema immunitario, ma per tutta la vita i risultati infezione. Soggetti immunocompromessi sono particolarmente suscettibili di toxoplasmosi e non dovrebbe maneggiare<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti. Le donne incinte non devono anche gestire<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti, perché l&#39;infezione può causare gravi difetti alla nascita<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti deve essere manipolato in uno spazio delimitato e con personale addestrato. Segnali che indicano<em&gt; T. gondii</em&gt; Lavoro oocisti è in corso devono essere inviati ad avvisare gli altri entrare nella zona designata.</li&gt;<li&gt; Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) come un camice da laboratorio, camice monouso, guanti monouso e protezione per gli occhi o una maschera per il viso durante la manipolazione<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti.</li&gt;<liCambiamenti guanto&gt; frequenti sono raccomandati. Non maneggiare qualsiasi attrezzatura di laboratorio con<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti contaminati guanti.</li&gt;<li&gt; Usare sempre vassoi di metallo autoclavabile rivestito con un liner assorbente usa e getta quando si lavora con<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti. Assicurarsi che tutti i rack, tubi, ecc utilizzati sono sia monouso o autoclavabili.</li&gt;<li&gt; Tutti i<em&gt; T. gondii</emRifiuti&gt; devono essere sterilizzati in autoclave due volte per almeno un&#39;ora.</li&gt;<li&gt; Tutti i materiali riutilizzabili (rack, vassoi, ecc) devono essere sterilizzati in autoclave due volte per almeno un&#39;ora.</li&gt;<li&gt; Linee di vuoto usato per aspirare i liquidi deve essere collegato ad un ™ Vacushield filtro per evitare la contaminazione della pompa per vuoto.</li&gt;<li&gt; Tutti di laboratorio affetti da banco cime devono essere disinfettati dopo aver completato il lavoro con<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti. Appena fatto ipoclorito 10% deve essere adottata per l&#39;area di lavoro e ha permesso a secco. L&#39;area deve essere sciacquato con acqua.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Preparazione di tamponi e soluzioni</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Preparare una soluzione L 1 2,2 M di saccarosio sciogliendo 752,66 g di saccarosio in 600 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Mescolate delicatamente e calore utilizzando una piastra riscaldata mescolare per sciogliere il saccarosio. Una volta completamente sciolto, portare al volume di 1 L con DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Questo dovrebbe essere seguita da sterilizzazione in autoclave la soluzione per almeno 20 minuti.</li&gt;<li&gt; Preparare una 1L tampone TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), a pH 7,2 con l&#39;aggiunta di 6,05 g di Tris-HCl e 3,7 g di EDTA in 700 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O, regolare il pH a 7,2 quindi portare al volume di 1 L con DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Per il gradiente di CsCl, preparare una soluzione stock di CsCl, con un peso specifico di 1,15 (1,15-CsCl) con l&#39;aggiunta di 21,75 g di CsCl con 103,25 ml di tampone TE. Per la soluzione A, miscelare 30 ml di TE con 20 ml di 1,15-CsCl. Per la soluzione B, mescolare 20 ml di TE con 30 ml di 1,15-CsCl e 12,5 ml di soluzione di rosso fenolo. Per Soluzione C, miscelare 10 ml di TE con 40 ml di 1,15-CsCl (Tabella 1).</li&gt;<li&gt; Preparare una 1L soluzione 1 N di idrossido di sodio (NaOH), sciogliendo 40 g di NaOH, in 800 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Una volta sciolto, portare al volume di 1 L con DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Preparare una soluzione 1 L 2% (in volume) di H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mescolando 20 ml di H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Con 980 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Saccarosio galleggiante</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Aggiungi 10 ml di una sospensione fecale di<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti, nel 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, In una provetta da centrifuga 50 ml. Si deve notare che la sospensione si riferisce a campioni fecali che sono stati pre-elaborati attraverso una procedura di galleggiamento saccarosio come descritto in precedenza<sup&gt; 8</sup&gt;. Quando i campioni di feci sono inizialmente raccolte dai gatti infetti sono elaborati attraverso un galleggiante saccarosio come descritto in riferimento 8. Questo galleggiante saccarosio supplementare è necessario per minimizzare ulteriormente i residui fecali riportati al processo di purificazione CsCl e ottenere il più puro<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocisti possibile.</li&gt;<li&gt; Neutralizzare l&#39;H 2%<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Con l&#39;aggiunta di 6 ml (3 / 5 volumi) di 1 N NaOH alla sospensione fecale. Mescolare bene nel vortex.</li&gt;<li&gt; Aggiungi un uguale volume (16 ml) di 2,2 M saccarosio creando una concentrazione finale di 1,1 M per la sospensione fecale e mescolare bene nel vortex.</li&gt;<li&gt; Cautela sovrapporre il saccarosio / sospensione fecale con 10 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O con una pipetta 10 ml. Centrifugare la sospensione a 1.200 xg per 20 minuti a temperatura ambiente senza alcun freno.</li&gt;<li&gt; Raccogliere accuratamente l&#39;acqua in alto e gli strati interfase e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml per centrifuga pipettando dal cielo-acqua, senza vorticosa la pipetta. E &#39;importante ridurre al minimo riporto saccarosio raccogliendo lo strato interfase.</li&gt;<li&gt; Mescolare la restante saccarosio / fecale soluzione pellet vortexando il tubo.</li&gt;<liRipetere&gt; passi 3.4 e 3.5.</li&gt;<li&gt; Portare il volume delle soluzioni oocisti due interfase a 50 ml con DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O e centrifugare le provette a 2000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.</li&gt;<li&gt; Aspirare il surnatante da ogni provetta e pellets risospendere con 5 ml di tampone TE e la piscina la sospensione oocisti insieme. Il volume totale pool dovrebbe essere di 10 ml.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Gradiente di CsCl</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Preparazione di un gradiente discontinuo CsCl in un tubo da 50 ml in policarbonato Oak Ridge con attenzione ogni strato sottostante mediante una siringa da 50 ml con un calibro 18 blunt-ended, autoclavabile, ago in acciaio, e un rubinetto a 2 vie. Nota: il rosso fenolo è aggiunto alla soluzione B di distinguere facilmente tra gli strati di pendenza (tabella 1).</li&gt;<li&gt; Aggiungere lentamente le seguenti soluzioni per il tubo nell&#39;ordine elencato di seguito. Va notato che la portata non deve superare più di 0,5 ml / sec.<ol&gt;<li&gt; 10 ml di TE / oocisti campione sospensione</li&gt;<li&gt; 8 ml Soluzione A</li&gt;<li&gt; 8 ml di soluzione B</li&gt;<li&gt; 8 ml Soluzione C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifugare la provetta Oak Ridge a 12.000 xg per 60 minuti a 4 ° C senza freno. L&#39;utilizzo di un rotore ad angolo fisso è accettabile, ma ad alta velocità oscillante risultati secchio in una migliore separazione delle oocisti dal campione sospensione con un minimo strisci fecali detriti lungo il fianco o il tubo. L&#39;entità del strisci dipende dalla composizione della sospensione fecale e quindi potrebbe essere necessario eseguire due gradienti di CsCl se la sospensione fecale è molto sporco.</li&gt;<li&gt; Dopo centrifugazione, raccogliere l&#39;opaco / bianco fascia oocisti contenente tra le soluzioni A e B. Per minimizzare la contaminazione con residui fecali, passare direttamente alla band oocisti senza disturbare il gradiente e raccogliere l&#39;interfase oocisti con una pipetta 10 ml. Trasferire il oocisti interfase a un nuovo tubo da centrifuga da 50 ml. Cercare di minimizzare la quantità di soluzione CsCl aspirato, mentre la raccolta dei oocisti interfase perché potrebbe essere un problema in cubettatura le oocisti durante la fase di lavaggio.</li&gt;<li&gt; Lavare le oocisti con 30-40 ml di DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Centrifugare la provetta a 2.000 xg a temperatura ambiente per 10 minuti senza freno. Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet oocisti. Ripetere il lavaggio due volte.</li&gt;<li&gt; Alla fine l&#39;ultimo lavaggio, accuratamente aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di acido solforico al 2% e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso. Oocisti sono ora pronti per ulteriori manipolazioni. Purezza oocisti possono essere controllati al microscopio per l&#39;assenza di residui fecali nel campione.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

ottenere altamente purificato toxoplasma gondii oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii è un protozoo intracellulare obbligato patogeno che infetta i comuni esseri umani. Si tratta di un Apicomplexa ben caratterizzato associati causando epidemie alimentare e idrica. L&#39;ospite definitivo è la specie felina in cui la replica sessuale si verifica con conseguente sviluppo delle oocisti altamente infettiva e ambientale resistente. L&#39;infezione avviene attraverso l&#39;ingestione di cisti tessuto da carni contaminate o oocisti dal suolo o acqua. L&#39;infezione è generalmente asintomatica nei soggetti sani, ma i risultati in una vita lunga infezione latente che può riattivare toxoplasmic causare l&#39;encefalite e la morte se l&#39;individuo diventa immunocompromessi. Carne contaminata con T. cisti gondii sono stati la fonte primaria di infezione in Europa e negli Stati Uniti, ma i recenti cambiamenti nella gestione degli animali e le pratiche di allevamento e manipolazione degli alimenti migliorata e le procedure di lavorazione hanno ridotto notevolmente la prevalenza di T. cisti gondii in carne 1, 2. Tuttavia, sieroprevalenza negli esseri umani rimane relativamente elevata suggerisce che l&#39;esposizione da oocisti suolo o acqua contaminati è probabile. Infatti, i focolai all&#39;acqua della toxoplasmosi sono stati segnalati in tutto il mondo a sostegno della teoria esposizione alla forma oocisti ambientale rappresenta un rischio significativo per la salute 3-5. Ad oggi, la ricerca sulla comprensione della prevalenza di T. oocisti gondii in acqua e l&#39;ambiente sono limitate a causa della mancanza di strumenti per rilevare oocisti nell&#39;ambiente 5, 6. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di protocolli di purificazione efficiente per ottenere un gran numero di oocisti altamente purificato T gondii da gatti infetti per scopi di ricerca. Questo studio descrive lo sviluppo di un metodo CsCl modificato che purifica facilmente T. gondii oocisti dalle feci di gatti infetti che sono adatti per biologia molecolare e della cultura manipolazione dei tessuti 7.

Questo studio descrive lo sviluppo di un metodo modificato CsCl che purifica facilmente T. gondii oocisti dalle feci di gatti infetti che sono adatti per biologia molecolare e la cultura manipolazione dei tessuti

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Toxoplasma gondii è un patogeno protozoario intracellulare obbligato che infetta comunemente l'uomo. È un apicomplexan ben caratterizzato associato a...

Toxoplasma Goia Osis sono generalmente ottenuti da feci di gatti infetti e isolati mediante una procedura di galleggiamento, che produce una sospensione parzialmente purificata, per analisi molecolari e colture cellulari. Tuttavia, gli esperimenti su questo parassita richiedono Osis altamente purificati per raggiungere tale scopo. Gli Osis vengono ulteriormente purificati mediante un passaggio di galleggiamento su saccarosio, in cui gli Osis vengono risospesi, sovrapposti con acqua una soluzione di saccarosio e centrifugati per separare gli Osis dalla maggior parte della materia fecale.Lo strato di osis viene quindi trasferito in un nuovo tubo sovrapposto a cloruro di cesio e centrifugato. La banda distinta di OSIS risultante viene quindi raccolta e lavata, pronta per essere utilizzata in esperimenti che richiedono teon purificato in modo elevato io assist. Salve, sono la dottoressa Sarah Staggs, dipendente di Dynam, un'appaltatrice del National Exposure Research Laboratory dell'US Environmental Protection Agency.Oggi vi mostreremo un procedimento per purificare Toxoplasma Gandhi io Oasis dalle feci di gatti infettati in laboratorio, utilizzando un gradiente discontinuo di cloruro di cesio. Questo procedimento viene utilizzato abitualmente nel nostro laboratorio per isolare OSI, da impiegare in esperimenti di biologia molecolare e colture cellulari. Cominciamo dunque.Prima di iniziare qualsiasi lavoro con TG O Osis, è necessario prendere in considerazione importanti aspetti di sicurezza. Le persone che sono immunocompromesse, in stato di gravidanza o che stanno cercando attivamente di rimanere incinte non dovrebbero manipolare l'agente patogeno a causa del rischio di contrarre la toxoplasmosi, che può causare malattie e gravi difetti congeniti. X.Per ridurre il rischio di infezione, è consigliabile riservare un'area dedicata per questa procedura ed esporre cartelli di avvertimento per informare gli altri prima che entrino nella stanza.Ricordarsi di indossare una camice da laboratorio, un camice monouso, guanti monouso e una protezione oculare adeguata o uno schermo facciale quando si maneggiano cisti T-One IO. È importante cambiare spesso i guanti ed evitare di toccare qualsiasi attrezzatura con guanti contaminati. È inoltre fondamentale lavorare su vassoi metallici sterilizzabili in autoclave, foderati con rivestimenti assorbenti monouso.E a questo proposito, prenditi un minuto per assicurarti che tutti i rack, i tubi e gli altri strumenti che prevedi di utilizzare siano monouso o autoclavabili. Se utilizzi articoli non monouso, assicurati di autoclavarli dopo l'uso per due cicli di un'ora ciascuno. Dovrai inoltre collegare tutte le linee di vuoto a un filtro di protezione per vuoto, per evitare di contaminare la pompa per vuoto.Una volta terminata l'isolazione dei cisti, sarà necessario applicare una soluzione fresca di ipoclorito al 10% sulla superficie di lavoro. Lasciarla asciugare, quindi risciacquare l'area più volte con acqua. Dopo aver adottato le opportune precauzioni di sicurezza, è possibile procedere con gli esperimenti.Prima del prelievo di T Guni OYS, è necessario preparare tutte le soluzioni richieste per il gradiente di saccarosio, galleggiamento e cloruro di cesio, nonché i passaggi di centrifugazione. Le soluzioni necessarie includono una soluzione di saccarosio 2,2 M sterilizzata mediante un ciclo di 20 minuti in autoclave, un litro di tampone TE a pH 7,2, una soluzione normale di idrossido di sodio, una soluzione al 2% di acido solforico e una soluzione madre di cloruro di cesio con una densità specifica di 1,15.La soluzione stock di cloruro di cesio 1,15 verrà utilizzata per preparare le soluzioni A, B e C, che saranno impiegate per creare il gradiente di cloruro di cesio. La soluzione A si ottiene mescolando 30 millilitri di TE con 20 millilitri di soluzione stock di cloruro di cesio 1,15; la soluzione B si prepara mescolando 20 millilitri di TE con 30 millilitri di soluzione stock di cloruro di cesio 1,15, quindi aggiungendo 12,5 microlitri di soluzione di fenored. Infine, la soluzione C viene preparata mescolando 10 millilitri di TE con 40 millilitri di soluzione di cloruro di cesio 1,15.Inizieremo la preparazione del gradiente al saccarosio prelevando una sospensione fecale di 10 millilitri di T osis in acido solforico al 2% e trasferendola in un tubo conico da centrifuga da 50 millilitri. La fonte del materiale fecale proviene da feci di gatti infetti che sono già state trattate mediante una procedura di flottazione al saccarosio precedentemente descritta in un manuale scritto dal Dott. JP Duby, intitolato Toxoplasmosis of Animals and Humans. Questo ulteriore passaggio riduce ulteriormente la quantità di detriti fecali nel processo di purificazione al cloruro di cesio e contribuisce a ottenere la massima purezza dei cisti di T goi.Neutralizziamo quindi l'acido solforico aggiungendo tre quinti del volume di una soluzione normale di idrossido di sodio alla sospensione fecale. Mescolare bene la sospensione mediante vortex. Successivamente, aggiungere un volume pari di saccarosio e mescolare bene la sospensione mediante vortex.Utilizzando 10 millilitri per provetta, sovrapporre con attenzione alla sospensione fecale di saccarosio 10 millilitri di acqua bidistillata. Una volta terminato con cura, posizionare le provette nella centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 1200 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente, senza frenata al termine della corsa. Avendo cura di non disturbare il pellet, prelevare delicatamente il liquido dalla superficie di separazione tra aria e acqua per raccogliere gli strati superiore acquoso e interfaciale.È molto importante cercare di minimizzare la quantità dello strato di saccarosio che viene trasferita durante il prelievo dello strato interfaciale. Trasferire questi strati in un nuovo tubo conico da centrifuga da 50 millilitri. Vortexare il tubo per mescolare la soluzione del pellet fecale contenente il saccarosio residuo.Ripetere nuovamente l'aggiunta di acqua e le fasi di centrifugazione precedenti. Al termine della centrifugazione, raccogliere gli strati superiore acquoso e di interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo. Utilizzare acqua bidistillata per portare il volume delle due soluzioni di interfaccia con i cisti a 50 millilitri.Quindi centrifugare i tubi a 2000 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine aspirare il soprannatante S da ciascun tubo. Ri-sospendere i pellet in cinque millilitri di buffer TE e sottoporre le sospensioni all'osmosi.Gli osi sono ora pronti per il passaggio del gradiente al cloruro di cesio. Inizieremo preparando un gradiente discontinuo di cloruro di cesio in un tubo Oak ridge in policarbonato da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri della sospensione contenente TE e osi utilizzando una siringa da 50 millilitri con un ago in acciaio autoclavabile da 18 gauge a estremit&agrave; smussata.E, tramite un rubinetto a due vie, aggiungere lentamente le seguenti soluzioni direttamente sul fondo del tubo. Otto millilitri di soluzione A, otto millilitri di soluzione B e otto millilitri di soluzione C. Assicurarsi che la velocità di flusso non superi 0,5 millilitri al secondo. È inoltre importante notare che il rosso fenolo presente nella soluzione B aiuta a distinguere gli strati del gradiente.Ora sei pronto per centrifugare il tubo Oak ridge a 12.000 × g per 60 minuti a quattro gradi Celsius senza frenata, utilizzando un rotore ad angolo fisso ad alta velocità. Al termine della centrifugazione, raccogliamo la banda bianca opaca tra le soluzioni A e B. Questa banda contiene gli oocisti. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, procedi direttamente verso la banda degli oocisti senza disturbare il gradiente e raccogli gli oocisti.Cerchi di minimizzare la quantità di soluzione di cloruro di cesio che aspira durante il prelievo della cisti, poiché un eccesso di cloruro di cesio potrebbe rendere difficile la formazione del pellet delle cisti durante il lavaggio. Successivamente, trasferisca l'OSIS in un nuovo tubo conico da centrifuga da 50 millilitri. Lavaggi ora le cisti O con 30-40 millilitri di acqua doppio-distillata e quindi centrifughi il tubo a 2000 ×g a temperatura ambiente per 10 minuti senza frenata; aspiri con attenzione il sopranatante avendo cura di non disturbare il pellet delle cisti O.Ripetere il lavaggio altre due volte. Una volta terminati gli ultimi lavaggi, aspirare con attenzione il sopranatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di acido solforico al 2%. Controllare l'OSIS al microscopio per assicurarsi che tutti i detriti fecali siano stati rimossi con successo dal campione.Gli osi sono ora pronti per ulteriori manipolazioni, oppure possono essere conservati a quattro gradi Celsius fino al momento del loro utilizzo. Ecco un'immagine di come appaiono gli osi non purificati, osservati al microscopio a contrasto di interferenza differenziale con un ingrandimento di 400 x. Si noti la presenza di grandi quantità di contaminanti fecali nel campo, che rendono molto difficile identificare gli assist OSI.Ecco come appaiono le OISS a 400 x dopo il protocollo di purificazione mediante gradiente al cloruro di cesio. Notare l'assenza di detriti fecali. Vi abbiamo appena mostrato come purificare Toxoplasma Gandhi Iasis dalle feci di gatti infetti in laboratorio utilizzando un gradiente discontinuo di cloruro di cesio.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di seguire tutte le norme di sicurezza e di essere sempre attenti durante l'aggiunta del gradiente di cloruro di cesio, inserendo ogni strato molto lentamente e cercando di non disturbare né mescolare il gradiente. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.

Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

Qui, descriviamo le condizioni di coltura in vitro , l'isolamento e l'aumento della generazione di vescicole extracellulari (EV) da Echinococcus granulosus. Le piccole vescicole extracellulari sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'assorbimento da parte delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo e la loro modulazione fenotipica sono stati studiati mediante microscopia confocale e citometria a flusso.

Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

Impara a purificare oocisti di Toxoplasma gondii con un gradiente discontinuo di cloruro di cesio. Questo metodo consente di ottenere campioni ad alta purezza per esperimenti di biologia molecolare e colture cellulari.

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

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