Colite Modeling murino utilizzando destrano sodio solfato (DSS)

I topi ricevono il 3% di DSS nell'acqua da bere per quattro giorni. Mentre peso corporeo, presenza di diarrea e sangue fecale vengono registrati quotidianamente, il DSS viene sostituito con acqua autoclavata dopo il quarto giorno. Dopo tre giorni di acqua, i topi vengono soppressi e i loro colon vengono rimossi.

I colon sono misurati e pesati. Successivamente, i colon vengono formati in rotoli svizzeri o salsicciotti ed esaminati al microscopio. Questo articolo video illustrerà il prelievo e il trattamento dei colon in un modello murino di colite.

Questa procedura viene utilizzata per lo studio della colite nel laboratorio del Dott. Christopher Williams del Dipartimento di Biologia del Cancro della Vanderbilt University, prima di iniziare il trattamento con sodio dextrina solfato. I pesi di base vengono registrati durante tutto il corso dell'esperimento. I pesi giornalieri vengono rilevati dopo aver pesato i topi, preparando una soluzione al 3% peso/volume di sodio dextrina solfato, o DSS, in acqua.

Il DSS deve avere un basso peso molecolare affinché questo modello sia efficace; preparare una quantità sufficiente di soluzione di DSS per riempire una bottiglia d'acqua per ogni gabbia di topi e filtrare la soluzione mediante un filtro in acetato di cellulosa da 0,45 micrometri. Sostituire la bottiglia dell'acqua da bere nella gabbia dei topi con una bottiglia contenente soluzione di DSS al 3%. Se l'istituto utilizza un sistema automatizzato di somministrazione dell'acqua, applicare apposite punte di esclusione agli erogatori per garantire che i topi non abbiano accesso ad alcuna altra fonte di acqua.

Dopo quattro giorni, i topi vengono pesati nuovamente per quantificare le conseguenze sistemiche della colite. La perdita di peso è comune in caso di lesioni gravi, tuttavia potrebbe non essere evidente per diversi giorni a partire dallo stesso giorno. Al quarto giorno, sostituire la soluzione di DSS con acqua per altri tre giorni, in modo da consentire un certo recupero dell'epitelio colico.

Tre giorni dopo, al settimo giorno, i topi vengono pesati nuovamente. Il colon può quindi essere prelevato dai topi sacrificati come mostrato nella prossima sezione. Per prelevare il colon, esporre la faccia ventrale del topo sacrificato per garantire un accesso ininterrotto all'addome.

Inumidire completamente l'addome con etanolo al 70%. Afferrare la linea mediana dell'addome con pinze per tessuti e sollevarla. In questo modo, sollevare la pelle utilizzando forbici a punta fine.

Incidi l'addome per esporre il contenuto addominale. Estendi l'incisione fino alla punta del processo xifoidi lungo la linea mediana, quindi continua lungo l'aspetto inferiore dei margini costali bilateralmente. Identifica l'intestino tenue, il cieco e il colon.

Dissezionare con attenzione o staccare il colon dal mesentere circostante. Successivamente, trassecare il colon in profondità verso il bacino per liberare il colon distale dal retto.

Occorre fare attenzione a non recidere arterie o vene. Inoltre, si tenga presente che il colon può lacerarsi facilmente. Pertanto, rimuovere delicatamente il colon dal mesentere.

Sezionare il colon al margine di sequela colona per liberare il colon prossimale. Rimuovere il colon e, utilizzando un ago da alimentazione da 20 gauge e una siringa da 10 millilitri, intubare e lavare il colon con PBS freddo ghiacciato fino a quando l'EIT risulti completamente privo di feci. È importante mantenere l'orientamento corretto del colon tenendo l'estremità distale del colon più vicina a voi.

Iniziare misurando la lunghezza del colon utilizzando un calibro digitale. La lunghezza del colon è un altro indicatore della gravità della lesione. La colite aumenta l'edema e riduce la lunghezza complessiva del colon.

A questo punto, i colon prelevati possono essere processati come salsicce per l'analisi macroscopica oppure trasformati in rotoli svizzeri per l'analisi istologica della colite acuta. Illustreremo queste tecniche nelle sezioni seguenti per processare il colon come una salsiccia. Per l'analisi macroscopica dell'intero colon, è importante mantenere l'orientamento corretto del colon. Pertanto, mantenete l'estremità distale del colon più vicina a voi.

Tagliare due pezzi di sutura non assorbibile, uno di circa un pollice di lunghezza e l'altro di due pollici. Utilizzare il pezzo di sutura da due pollici per legare l'estremità distale del colon il più vicino possibile al margine, garantendo comunque una buona tenuta. Successivamente, inserire un ago da alimentazione da 20 gauge contenente cinque millilitri di formalina fosfato tamponata al 10% nell'estremità prossimale del colon.

Legare in modo lento il pezzo rimanente del filo chirurgico immediatamente prossimale alla bulbo dell'ago di alimentazione. A questo punto afferrare saldamente il colon al livello del bulbo dell'ago di alimentazione e infondere una quantità sufficiente di formalina, assicurandosi che il colon si espanda. Stringere il nodo del filo mentre si ritira l'ago di alimentazione, lasciando così il colon espanso e infuso.

Come per un salsicciotto, riempire un tubo conico da 15 millilitri con soluzione tamponata al 10% di formalina e fosfato, e etichettare il tubo. Posizionare il colon nel tubo e fissare per 24 ore. Dopo 24 ore, versare la formalina in un contenitore adeguato per rifiuti e sostituirla con etanolo al 70% per ulteriori 24 ore.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% indefinitamente a temperatura ambiente. Quando si è pronti per analizzare il colon, rimuoverlo dal tubo conico. Tagliare i lacci alle estremità con un bisturi, avendo cura di non danneggiare il colon.

Ricordare che l'estremità distale presenta il pezzo di corda più lungo. Tagliare il colon longitudinalmente dall'estremità distale a quella prossimale in modo che formi una striscia allungata. Il colon può ora essere osservato al microscopio stereoscopico.

Tagliare longitudinalmente il colon e dispiegarlo come una lamina piatta. Arrotolare il colon richiede due paia di pinze e una tecnica a due mani. Afferrare entrambi i margini laterali del bordo distale del colon con le pinze e procedere arrotolando successivamente il colon mediante rotazione e rilascio delle pinze, avanzando verso il margine prossimale, generando così una spirale tridimensionale o "Swiss roll".

Se il colon aderisce alla carta Watman, inumidire la carta e il colon con una piccola quantità di PBS per mantenerne la forma. Afferrare saldamente il rotolo con pinze e sezionarlo con un ago da 27 e mezzo. Fissare il rotolo piegando l'ago mentre esce dal rotolo.

Ora, posizionare l'arrotolamento in una cassetta per tessuti etichettata e inserire la cassetta in un barattolo contenente formalina fosfato tamponata al 10%. Lasciare a temperatura ambiente per 24 ore per fissare il tessuto. Dopo 24 ore, versare via la formalina e sostituirla con etanolo al 70% per un ulteriore periodo di quattro ore.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% indefinitamente a temperatura ambiente. Questo modello consente al ricercatore di ottenere, fissare e analizzare i colon, permettendo così l'analisi della gravità della colite. Per l'analisi macroscopica dell'intero colon, il colon può essere processato come un salsicciotto che viene infuso con formalina ed espanso completamente.

La sezione aperta del salsicciotto deve essere appiattita. Se il metodo del salsicciotto è stato eseguito correttamente, il colon fissato risulterà dilatato e l'intera superficie mucosa potrà essere facilmente manipolata e osservata al microscopio stereoscopico. Per l'analisi istologica, il colon può essere processato secondo la tecnica a rotolo svizzero.

Il rotolo viene fissato con un ago e collocato in una cassetta per tessuti per la fissazione. Quando il rotolo viene tagliato e montato, dovrebbe formare una sezione rappresentativa dell'intero colon, se arrotolato correttamente; le sezioni del rotolo svizzero possono essere colorate con ematina e ASIN per determinare l'entità del danno colico. Ricordare che l'estremità distale del colon si trova al centro del rotolo sul vetrino.

In questo esempio, l'infiammazione e il danno criptico sono evidenti nel colon trattato con DSS rispetto a un controllo trattato con acqua. Vi abbiamo appena mostrato come raccogliere ed elaborare i colon da un modello murino di colite acuta. Quando si esegue questa procedura, è importante essere ben organizzati prima dell'eutanasia.

I topi, ad esempio, devono avere tutti i tubi e le cassettes etichettati per ciascun topo e tutti gli strumenti e i reagenti prontamente disponibili. Inoltre, mantenere registri dettagliati del peso corporeo e della lunghezza del colon dei topi. Infine, assicurarsi di aver previsto tempo sufficiente per l'elaborazione.

Di solito richiede 15 minuti per topo per un principiante e da sei a otto minuti per una persona più esperta in questa tecnica.