Colite Modeling murino utilizzando destrano sodio solfato (DSS)

Ai topi viene somministrato il 3% di DSS alla libido per quattro giorni. Mentre il peso e la presenza di diarrea e sangue fecale vengono registrati quotidianamente, la TSS viene sostituita dall'acqua dell'autoclave dopo il quarto giorno. Dopo tre giorni in acqua, i topi vengono soppressi e i loro colon vengono rimossi.

I due punti vengono misurati e pesati. I colon vengono quindi trasformati in involtini svizzeri o salsicce ed esaminati al microscopio. Questo articolo video dimostrerà la raccolta e la lavorazione dei colon in un modello murn di colite.

Questa procedura viene utilizzata per studiare la colite nel laboratorio del Dr.Christopher Williams del Dipartimento di Biologia del Cancro della Vanderbilt University prima di iniziare il trattamento con destrina solfato di sodio. I pesi di base sono ottenuti nel corso dell'esperimento. I pesi giornalieri vengono presi dopo che i topi sono stati pesati, fare un 3% in peso per volume, destrina solfato di sodio soluzione salina o DSS in acqua.

Il DSS deve essere di un basso peso molecolare affinché questo modello sia efficace, preparare una soluzione DSS sufficiente a riempire una bottiglia d'acqua per ogni gabbia di topi e filtrare la soluzione con un filtro in acetato di cellulosa da 0,45 micrometri. Sostituire la bottiglia di acqua potabile nella gabbia per topi con una bottiglia contenente una soluzione DSS al 3%. Se il tuo istituto utilizza un sistema di irrigazione automatizzato, posiziona le punte di esclusione sui beccucci di irrigazione per assicurarti che i topi non abbiano accesso a nessun'altra fonte d'acqua.

Dopo quattro giorni, i topi vengono nuovamente pesati per quantificare le conseguenze sistemiche della colite. La perdita di peso è comune con lesioni gravi, tuttavia, potrebbe non essere evidente per diversi giorni nello stesso giorno. Quarto giorno, sostituire la soluzione DSS con acqua per altri tre giorni per consentire un recupero epiteliale del colon.

Tre giorni dopo, il settimo giorno, i topi vengono pesati di nuovo. Il colon può quindi essere raccolto dai topi soppressi come mostrato nella sezione successiva. Per prelevare il colon, esporre il lato ventrale del topo soppresso per garantire un accesso senza ostacoli all'addome.

Bagnare completamente l'addome con etanolo al 70%. Afferrare la linea mediana dell'addome con una pinza per tessuti ed elevare. Quindi tendendo la pelle usando forbici a punta fine.

Incidere l'addome per esporre il contenuto addominale. Estendere l'incisione fino alla punta del processo xifoideo sulla linea mediana, quindi estenderla bilateralmente lungo l'aspetto inferiore dei margini costali. Identificare il cieco dell'intestino tenue e il colon.

Sezionare con cura, tagliare, stuzzicare il colon dal mesentere circostante. Dopodiché, sezionare il colon e approfondire il bacino per liberarlo. Il colon distale dal retto.

Bisogna fare attenzione in modo che non vengano tagliate arterie o vene. Inoltre, tieni presente che il colon può strapparsi facilmente. Quindi rimuovi delicatamente il colon dal mesentere.

Sezionare il colon al margine del sequel della colona per liberare il colon prossimale. Rimuovere il colon e il totale utilizzando un ago da 20 gauge e una siringa da 10 millilitri, intubare e sciacquare il colon con PBS ghiacciato fino a quando l'EIT non è completamente libero dalle feci. È importante mantenere il corretto orientamento del colon mantenendo l'estremità distale del colon più vicina a te.

Inizia misurando la lunghezza del colon utilizzando un calibro digitale. La lunghezza del colon è un altro indicatore della gravità della lesione. La colite aumenta l'edema e accorcia la lunghezza complessiva del colon.

A questo punto, i colon raccolti possono essere trasformati in salsicce per l'analisi macroscopica o trasformati in rotolo svizzero per l'analisi istologica della colite acuta. Dimostreremo queste tecniche nelle sezioni seguenti per elaborare il colon come una salsiccia Per l'analisi macroscopica dell'intero colon, è importante mantenere il corretto orientamento del colon. Pertanto, tieni l'estremità distale del colon più vicina a te.

Taglia due pezzi di sutura non assorbibile, uno di circa un pollice di lunghezza e l'altro di due pollici di lunghezza. Usa il pezzo di sutura da due pollici per legare l'estremità distale del colon il più vicino possibile al margine, pur mantenendo una buona tenuta. Quindi posizionare un ago da 20 gauge contenente cinque millilitri di formalina fosfato tamponato al 10% nell'estremità prossimale del colon.

Legare senza stringere il pezzo di sutura rimanente immediatamente prossimalmente al bulbo dell'ago di alimentazione. Ora afferra saldamente il colon sul bulbo dell'ago di alimentazione e infondi una quantità sufficiente di formalina assicurandoti che il colon sia espanso. Stringere il nodo nella sutura mentre si ritira l'ago di alimentazione, lasciando così il colon espanso infuso.

Come salsiccia, riempire un tubo conico da 15 millilitri con il 10% di tampone, formale e fosfato ed etichettare il tubo. Posizionare il colon nel tubo e fissare per 24 ore. Dopo 24 ore, versare la formina in un contenitore per rifiuti appropriato e sostituirla con etanolo al 70% per altre 24 ore.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% a tempo indeterminato a temperatura ambiente. Quando sei pronto per analizzare il colon, rimuovilo dal tubo conico. Tagliate i fili su ogni estremità con un bisturi facendo attenzione a non danneggiare il colon.

Ricorda che l'estremità distale ha il pezzo di corda più lungo. Tagliare il colon longitudinalmente dall'estremità distale a quella prossimale in modo da formare un lungo foglio. Il colon può ora essere visualizzato al microscopio da dissezione.

Taglia il colon longitudinalmente e stende il colon come un foglio piatto. Il rotolamento del colon richiede due paia di pinze e una tecnica a due mani. Afferrare entrambi i bordi laterali del margine distale del colon con una pinza e procedere a ruotare in sequenza il colon ruotando e rilasciando la pinza che procede verso il margine prossimale, generando così una spirale con una terza dimensione o rullo svizzero.

Se i due punti aderiscono alla carta watman, bagnare la carta e il colon con una piccola quantità di PBS per mantenere la forma. Afferrare saldamente il rotolo con una pinza e sezionare con un ago calibro 27 e mezzo. Fissare il rullo piegando l'ago mentre esce dal rotolo.

Ora, metti il rotolo in una cassetta di carta etichettata e metti la cassetta in un barattolo di fosfato di formalina tamponato al 10%. Lasciare a temperatura ambiente per 24 ore per fissare il tessuto. Dopo 24 ore, versare la formalina e sostituirla con etanolo al 70% per altre quattro ore.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% a tempo indeterminato a temperatura ambiente. Questo modello consente al ricercatore di ottenere, fissare e analizzare il colon, consentendo così l'analisi della gravità della colite. Per l'analisi macroscopica dell'intero colon, il colon può essere lavorato come una salsiccia infusa con formalina e completamente espansa.

La salsiccia aperta dovrebbe essere piatta. Se il metodo della salsiccia è stato eseguito correttamente, il colon fisso verrà dilatato e l'intera superficie della mucosa può essere facilmente manipolata e visualizzata al microscopio da dissezione. Per l'analisi istologica, il colon può essere processato come un rotolo svizzero.

Il rotolo viene fissato con un ago e inserito in una cassetta di tessuto per il fissaggio. Quando il rotolo viene tagliato e montato, dovrebbe formare una fetta rappresentativa dell'intero colon se arrotolato correttamente, le sezioni del rotolo svizzero possono essere macchiate con ematina e ASIN per determinare l'entità della lesione del colon. Ricordando che l'estremità distale del colon si trova al centro del rotolo sul vetrino.

In questo esempio, l'infiammazione e il danno alla cripta sono evidenti nel colon trattato con DSS rispetto a un controllo trattato con acqua. Vi abbiamo appena mostrato come raccogliere e processare il colon da un modello murino di colite acuta. Quando si esegue questa procedura, è importante essere ben organizzati prima di sacrificare.

I topi, ad esempio, hanno tutte le provette e le cassette etichettate per ogni topo e tutti gli strumenti e i reagenti prontamente disponibili. Inoltre, mantenere registri dettagliati del peso del topo e della lunghezza del colon. Infine, assicurati di aver assegnato abbastanza tempo per l'elaborazione.

Di solito ci vogliono 15 minuti per mouse per un principiante e da sei a otto minuti per qualcuno più esperto in questa tecnica.