Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare le condizioni ottimali di elettroporazione per la trasfezione di linee cellulari primarie utilizzando fibroblasti embrionali di topo o mfs. A titolo di esempio, le cellule MF e l'acido nucleico di interesse vengono caricate in una piastra di elettroporazione a 96 pozzetti collegata al sistema Gene Pulser MX Cell, che consente di testare più condizioni di elettroporazione in un unico esperimento. Per gli esperimenti di ottimizzazione, le cellule vengono coltivate dopo l'elettroporazione e analizzate per valutare l'efficienza di trasfezione.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza episcopica e la citometria a flusso, è possibile selezionare le condizioni di elettroporazione più efficienti per futuri transfezioni. Ciao, sono Adam McCoy, scienziato senior della Divisione di Espressione Genica di BioRad Laboratories. Oggi vi mostreremo un procedimento per identificare facilmente le migliori condizioni di elettroporazione per la transfezione di linee cellulari primarie.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'espressione genica in queste cellule. Oggi userò tre numeri di passaggio diversi di mes o fibroblasti embrionali di topo. Utilizzo colture con numeri di passaggio diversi per due motivi.

Prima di tutto, mostrerò quanto sia importante la salute cellulare: con linee cellulari primarie, anche solo pochi giorni in più in coltura possono fare la differenza in termini di efficienza di trasfezione. In secondo luogo, desidero mostrare che il processo di identificazione delle migliori condizioni è lo stesso, anche se l'efficienza di trasfezione diminuisce con le cellule più vecchie. Probabilmente il tuo esperimento non prevederà cellule di età diverse.

È possibile seguire lo stesso procedimento con il proprio disegno sperimentale. Se si desidera confrontare l'espressione genica tra cellule di controllo e trattate, si possono innanzitutto individuare le condizioni ottimali e poi eseguire l'esperimento utilizzando le condizioni identificate. In alternativa, è possibile effettuare contemporaneamente l'ottimizzazione e l'esperimento.

Come mostrerò oggi, utilizzerò un plasmide che codifica per la GFP per valutare l'efficienza di trasfezione mediante citometria a flusso. Tuttavia, la procedura di elettroporazione sarebbe identica anche se si facesse qualcosa di diverso, ad esempio l'introduzione di irna e l'analisi dell'espressione genica mediante PCR in tempo reale. Cominciamo dunque.

I fibroblasti embrionali murini, o mets utilizzati in questo protocollo, sono cellule aderenti. Pertanto, il primo passaggio nel lavorare con queste cellule consiste nel distaccarle dal fondo della fiasca utilizzando protocolli standard di coltura tissutale che prevedono la tripsinizzazione. Dopo che le cellule si sono staccate dalla fiasca, neutralizzare la tripsina con mezzo contenente siero e raccogliere le cellule in provette coniche da 50 millilitri.

Dopo aver raccolto le cellule, centrifugarle una volta che sono state formate in pellet. Devono essere lavate mediante risospensione in un volume noto di PBS. Dopo averle risospese completamente, contare le cellule sapendo che sarà necessaria una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro per gli esperimenti di elettroporazione.

Calcolare il numero appropriato di cellule in base al conteggio cellulare e trasferirle in una provetta pulita. Centrifugare ulteriormente per ottenere il pellet cellulare. Rimuovere quindi con attenzione il soprannatante.

Risospendere le cellule nel buffer per elettroporazione a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro e aggiungere 20 microgrammi per millilitro del plasmide. Le piastre sono suddivise in 96 pozzetti con colonne numerate da 1 a 12 e righe da A a H; ogni gruppo di quattro pozzetti, o serie di pozzetti, condivide una coppia di piastre elettrode, in modo che le cellule in quei pozzetti ricevano lo stesso impulso. Ad esempio, i pozzetti 1A, 1B, 1C e 1D sono elettricamente connessi in un'unica serie di pozzetti e riceverebbero tutti lo stesso impulso.

Il successivo gruppo di quattro pozzetti, A, B, C e D, riceverà tutti il secondo impulso quando il protocollo viene avviato, anche se i parametri possono essere identici. La piastra da 96 pozzetti per elettroporazione è inoltre configurata in modo che la metà superiore e la metà inferiore della piastra siano separate. Pertanto, i pozzetti E, F, G e H nella parte inferiore della piastra ricevono un impulso unico, distinto da quello ricevuto dai pozzetti A, B, C e D nella parte superiore.

In questo esperimento, verrà utilizzata solo metà della piastra. I primi tre pozzetti di ogni serie di pozzetti contengono cellule di età diverse. Le cellule della riga superiore, riga A, sono state passaggiate cinque volte.

Le cellule della riga B sono state passaggiate nove volte e quelle della riga C sono state passaggiate 13 volte. La riga D contiene solo buffer per elettroporazione prima dell'elettroporazione. È consigliabile verificare il proprio protocollo per assicurarsi che le impostazioni siano corrette.

Questo protocollo erogherà sei impulsi a decadimento esponenziale seguiti da sei impulsi a onda quadra. Gli impulsi a decadimento esponenziale aumentano da 200 volt a 450 volt e utilizzano tutti soltanto 350 micro ferretti. A causa della bassa resistenza del buffer per impulsi genici o di elettroporazione utilizzato.

Gli impulsi a onda quadra variano sia in tensione che in durata dell'impulso. La regolazione della capacità dello strumento deve essere adattata alla conduttanza della miscela di elettroporazione. Se si utilizza un buffer ad elevata resistenza per l'elettroporazione, come DMEM, si potrebbe usare lo stesso intervallo di tensione, ma con una capacità maggiore, ad esempio 950 microfarad per gli impulsi a decadimento esponenziale.

Se la capacità ottimale del buffer in uso non è nota, sarà necessario variare anche la capacità nelle condizioni di elettroporazione che si stanno testando. Il passo successivo consiste nel caricare 150 microlitri di miscela cellula-plasmide in ciascun pozzetto utilizzato per questo esperimento. Il quarto pozzetto di ciascun set di pozzetti utilizzato viene riempito con buffer per elettroporazione.

Dopo aver caricato la piastra, inserirla nella camera della piastra MXL e chiudere il coperchio. Quindi premere pulse per atare le cellule. L'ator eroga impulsi elettrici in sequenza a ciascun pozzetto secondo le condizioni specificate nel protocollo scelto.

Sono necessari pochi secondi per elettroporare tutte le cellule. Al termine dell'impulso, rimuovere la piastra dalla camera della piastra mix sent. Trasferire le cellule da ogni pozzetto in una piastra di coltura contenente mezzo di coltura preriscaldato.

Queste cellule mes sono coltivate in DMEM integrato con FBS al 10%. I campioni di controllo, non elettroporati, vengono prelevati dalla miscela residua di cellule e plasmidi e aggiunti a piatti di coltura contenenti la coltura pre-riscaldata. Il mezzo ha la stessa composizione di quello utilizzato per le cellule elettroporate. Infine, agitare delicatamente.

Quindi agitare leggermente la piastra per distribuire le cellule prima di posizionarla nell'incubatore per 24 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, prima di analizzare l'efficienza di trasfezione e identificare quali condizioni di elettroporazione sono le migliori per il vostro esperimento. Una volta identificate le condizioni ottimali di elettroporazione, si può scegliere tra due metodi di elettroporazione per esperimenti futuri. Lo sperimentatore può decidere se continuare a seminare le cellule in piastre a 96 pozzetti oppure se seminare le cellule in cuvette, un campione alla volta.

Le cuvette possono analizzare un solo campione alla volta e richiedono un volume quattro volte superiore rispetto a quello necessario per un singolo pozzetto delle piastre a 96 pozzetti, ma le singole cuvette sono meno costose e più semplici da utilizzare quando è necessario analizzare un numero ridotto di campioni. Il sistema Gene Pulser o MX Cell è progettato in modo da permettere l'utilizzo delle stesse impostazioni di elettroporazione sia con le piastre che con le cuvette. Invece della camera a piastra, utilizzare il modulo di shock MXL per le cuvette.

Scollegare la camera della piastra dalla parte posteriore dello strumento e collegare il modulo di shock. Poiché il modulo di shock eroga solo l'impulso programmato per il set di pozzetti A, B, C, D uno, potrebbe essere necessario selezionare un programma diverso. Per selezionare un programma precedentemente salvato, premere home.

Quindi selezionare l'opzione tre, protocolli utente. Se ci si trova già nella cartella utente corretta, premere invio per selezionare i protocolli utente e scorrere verso il basso. Per evidenziare il programma corretto, premere invio per selezionare tale programma.

Lo strumento è ora pronto. Dopo aver selezionato il programma, preparare le cuvette. La miscela di plasmide e MEF viene preparata nello stesso modo illustrato in precedenza.

Caricare ogni vet del diametro di 0,4 centimetri con lo stesso volume utilizzato per un intero set di pozzetti. Nelle piastre a 96 pozzetti. Poiché un set di pozzetti comprende quattro pozzetti e sono stati utilizzati 150 microlitri di tampone o di miscela cellulare per ogni pozzetto, si impiegano 600 microlitri di miscela cellulare plasmidica per ogni vet.

Successivamente, posizionare la provetta nella camera del dispositivo per lo shock elettrico, quindi premere "pulse" per erogare lo shock elettrico alle cellule. Dopo l'elettroporazione, procedere come nel metodo della piastra: mescolare le cellule, quindi trasferire aliquote in piastre per colture cellulari contenenti mezzo preriscaldato, impostando un controllo. Agitare delicatamente la piastra e batterla leggermente nei pozzetti che non sono stati sottoposti a elettroporazione.

Quindi lasciare le cellule a ripristinarsi per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima di analizzare l'efficienza di trasfezione dopo aver tranciato le cellule e aver loro permesso di riprendersi. Analizzare l'efficienza di trasfezione in modo qualitativo mediante microscopia epifluorescente e in modo quantitativo mediante citometria a flusso. Le cellule che sono state elettroporate con successo e che ora esprimono il gene GFP appaiono verdi in microscopia epifluorescente; qui è mostrato un risultato tipico di successo. L'osservazione delle cellule in contrasto di fase permette la visualizzazione sia delle cellule trasfettate che di quelle non trasfettate.

Qui sono mostrate le cellule esposte all'impulso di elettroporazione con la tensione più bassa, a 200 volt. Le cellule sono in gran parte confluenti a causa dell'elevata densità cellulare. Lo stesso campo visivo in fluorescenza episcopica mostra che un certo numero di cellule esprime il marcatore GFP, ma queste rappresentano solo una piccola percentuale delle cellule visibili nell'immagine precedente a 250 volt.

Il numero totale di cellule vive osservato in contrasto di fase diminuisce leggermente in fluorescenza episcopica. Possiamo notare che il numero di cellule che esprimono GFP è aumentato al voltaggio più elevato applicato, 375 volt. Sono visibili meno cellule vive, tuttavia una grande percentuale delle cellule rimanenti esprime GFP.

La condizione ottimale dipende dal disegno sperimentale. In alcuni esperimenti, potrebbe essere ottimale il numero più elevato di cellule trasfettate. In altri esperimenti, potrebbe essere preferibile la percentuale più alta di trasfezione.

Siamo interessati alla percentuale di cellule GFP positive in ciascuna condizione e a come queste percentuali variano in funzione del flusso dell'età cellulare. La citometria può fornire informazioni quantitative sui risultati della trasfezione in ciascuna delle diverse condizioni di elettroporazione. Qui vengono mostrate le percentuali di cellule GFP positive nel passaggio.

Cinque cellule. In ognuna delle 12 condizioni di elettroporazione, la percentuale massima di trasfezione è stata approssimativamente dell'80% con il decadimento esponenziale alla tensione più elevata. La condizione di impulso sei e 70 con l'onda quadra più intensa testata, condizione 12, con le cellule passate nove volte prima dell'elettroporazione.

Il modello complessivo della percentuale di trasfezione è quasi identico, ma con una leggerissima diminuzione delle percentuali di trasfezione riportate. Di seguito sono indicate le percentuali di cellule GFP nelle cellule al passaggio 13, che mostrano una marcata riduzione della percentuale di trasfezione rispetto alle cellule più giovani. Le percentuali di trasfezione più elevate erano approssimativamente la metà di quelle ottenute con le cellule più giovani, dimostrando l'importanza di utilizzare cellule sane il più possibile subito dopo l'isolamento.

Vi ho appena mostrato come utilizzare il sistema di elettroporazione MXL per identificare le condizioni ottimali per mappare elettroprobing o altre linee cellulari primarie. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare cellule sane il più possibile subito dopo l'isolamento e di adottare condizioni di elettroporazione adeguate al tampone di elettroporazione. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.