Name: Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri come visualizzare in tempo reale la formazione dei complessi di riparazione del DNA in Bacillus subtilis utilizzando fusioni proteiche con GFP. Questo metodo avanzato permette di studiare la dinamica della riparazione degli errori di accoppiamento nelle cellule viventi.

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Gli autori desiderano ringraziare Drs. Philina S. Lee e Alan D. Grossman per la formazione inizialmente LAS in microscopia a fluorescenza. Gli autori hanno anche ringraziare Drs. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi aiuto e suggerimenti per l&#39;imaging. Questo lavoro è stato supportato da start-up fondi del Collegio di Letteratura, Scienze e Arti e dal Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo presso l&#39;Università del Michigan.

Colture di cellule in crescita per microscopia 1. Uno o due giorni prima di imaging, preparare la B. subtilis ceppo contenente la proteina di fusione traslazionale che si desidera visualizzare. Turni di prova di 1A e 1B passi saranno necessari per determinare quale condizione di crescita fornisce le migliori immagini del vostro sforzo. Nella maggior parte dei casi, le cellule dovrebbero essere esposte durante la fase di crescita esponenziale. <ol class="ualpha"><li> Per alcune B. ceppi subtilis (in particolare, i ceppi che crescono poco, grazie all'integrazione della fusione traslazionale tra il gene di interesse e GFP al suo locus endogena), la crescita iniziale per due giorni precedenti l'imaging è necessario per immagini di alta qualità. Il primo giorno, striscia la B. subtilis ceppo di essere ripreso su agar LB con antibiotico selettivo (s) e incubare una notte a 30 ° C. Il secondo giorno, inoculare 100 l di soluzione salina allo 0,85% con una singola colonia ed eseguire tre diluizioni di 10 volte seriale su piastre di agar LB (con antibiotici selettivi), placcatura 100 l di ogni diluizione, seguita dalla notte di incubazione a 30 ° C. Il terzo giorno, selezionare la piastra di diluizione con luce crescita confluente di cellule. Luce crescita confluente su un piatto fornirà il terreno di coltura con una sana e in crescita esponenziale inoculo starter per produrre potenzialmente ottimi risultati di imaging (vedi punto 4). Questa fase è particolarmente utile per l'imaging di altissima qualità a membrana con la macchia FM4-64. </li><li> Altri B. ceppi subtilis possono semplicemente essere applicate a terreno selettivo agarizzato LB per singole colonie con un bastone sterile il giorno prima di imaging e incubare una notte a 30 ° C. Il giorno seguente, le celle su questa piastra sarà sufficiente utilizzare come inoculo per l'imaging (vedi punto 4). NOTA: per B. subtilis, culture durante la notte in mezzo liquido non sono adatti a causa di una combinazione di formazione di spore e le risposte del quorum, che farà un lungo periodo di crescita ritardo di fase 1. </li></ol> 2. La mattina di imaging versare 10 ml di S7 50 media 1-3 in un pallone da 125 ml Erlenmeyer sterile. 3. Risospendere le cellule in un massimo di 2 ml di S7 50 di media dalla piastra LB agar con singole colonie o le cellule confluenti luce per ottenere un inoculo. 4. Aggiungi sufficiente S7 50 medio-cell inoculo per la beuta contenente 10 ml S7 50 di media per una cultura con una densità iniziale ottica misurata a 600 nm (OD 600) di ~ 0,08-0,1. A questo punto è importante avere almeno 10 volte l'aria al rapporto medio. Quindi, utilizziamo 10-12,5 mL di terreno inoculato in un pallone di 125 ml Erlenmeyer. 5. Crescono ogni cultura a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno 600 ~ 0,5-0,8. Bagni di acqua agitazione sono da preferire con giri al minuto da 150-200. Culture sfidato con gli agenti che danneggiano il DNA inducendo o mancata corrispondenza dovrebbe essere in una fase iniziale di crescita esponenziale OD 600 in modo tale che le cellule raggiungerà l'obiettivo OD 600 con l'ulteriore periodo di crescita che è necessario per il trattamento (vedi tabella 1) Per esempio, 2-aminopurine richiede un'ora di trattamento, e quindi una cultura trattati con 2-aminopurine dovrebbe essere di 0,3-0,4 OD 600 ~, tale che l'un'ora di trattamento / risultati di crescita in un OD 600 ~ 0,5-0,8, per cui le cellule sono pronte per l'imaging. Preparazione del campione 1. Pipettare 300 ul di cellule in coltura in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. 2. Se l'imaging delle membrane cellulari si desidera, aggiungere 1:1000 diluizione di FM4-64 membrana macchia (Invitrogen) per ogni campione da un mg / 1 ml soluzione madre. Una titolazione di FM4-64 può essere richiesto per ottenere il segnale di fluorescenza desiderato. Una gamma titolazione tipica è 1:100, 1:1000 e 1:10.000. 3. Lasciare i campioni a temperatura ambiente fino a una decina di minuti, mentre la diapositiva si sta preparando con 1% di agarosio in 1X medio Spizizens come descritto di seguito (vedi punto 1 di "preparazione del vetrino"). 4. Se la concentrazione di cellule è richiesto, noi preferiamo celle filtranti con filtro da 0,2 micron con un apparato vuoto. Le celle possono poi essere lavati delicatamente dalla superficie del filtro con PBS, un altro tampone appropriato o medio prima di visualizzazione. Far scorrere la preparazione 1. Preparare l'1% di agarosio con 1X Spizizens. Aggiungere 5 ml di 10X magazzino Spizizens a 45 ml ddH2O con 0,5 g di agarosio, e forno a microonde a sciogliersi. Agarosio fuso a caldo è difficile da pipetta, e solidificato agarosio non entrerà la punta della pipetta. L'agarosio devono essere equilibrati in un bagno d'acqua ad una temperatura di circa 55-65 ° C, per entrare la punta della pipetta senza solidificazione all'interno del punta. 2. Disegna 20 l di Spizizens con 1% di agarosio fuso nella punta della pipetta. Pipetta una goccia (circa 1-2 mL) della soluzione di agarosio in ogni pozzetto (usiamo pure 15-diapositive, vedi Tabella 2) per formare superficiale pastiglie agarosio. L'agarosio si solidificano immediatamente. Le diapositive devono essere fatte immediatamente prima dell'applicazione delle cellule. Se le pastiglie di agarosio vengono lasciati a temperatura ambiente da soli, possono disidratarsi in pochi minuti e diventano inutilizzabili. Pastiglie agarosio deve essere centrato e riempire ogni bene, ma hanno l'altezza minima per evitare di interrompere il coprioggetto, se le gocce sono troppo elevati (bubble-simili) o se il campione si estende al di là del confine bene, è sufficiente passare il bene pulire con un Kimwipe e applicare un agarosio nuovo pad. 3. Applicare l'intero campione di 300 microlitri (vedi punto 6) alla diapositiva, distribuiti in cima ad ogni pad agarosio. Questa quantità di cellule dovrebbe essere sufficiente a coprire ogni pozzetto nella diapositiva. 4. Lasciare il vetrino caricato con celle a temperatura ambiente (23 ° C) per circa dieci minuti. Questo passo consentirà alle cellule di stabilirsi sul pad agarosio diventando immobile e pronto per l'imaging. Per esigenze specifiche questa temperatura può avere bisogno di essere cambiato, per esempio, durante l'esecuzione di esperimenti che richiedono un cambiamento di temperatura 4. 5. Aspirare via del mezzo in eccesso da ogni pozzetto senza rimuovere le pastiglie stesse. 6. Applicare il coprioggetto alla diapositiva, premendo con decisione e in modo uniforme, ma delicatamente, tutta l'area della diapositiva. Verificare che la polizza di copertura è contro la diapositiva e che la polizza di copertura non viene sollevata sopra il vetrino. Visualizzazione di cellule 1. Molti microscopi a fluorescenza diversi funzionerà bene. E 'fondamentale avere un 100X lente immersione in olio. Il laboratorio utilizza Simmons: <ul><li> Olympus BX61 microscopio dotato di 1,45 lente NA TIRFM olio obiettivo 100X ad immersione </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 telecamera CCD raffreddata </li><li> Lumen 200 arco in metallo (Prima) fonte di luce. </li><li> Per il rilevamento di GFP (CIC), filtro eccitazione ed emissione 460-500 510-560 </li><li> Per il rilevamento di FM4-64 (TRITC), filtro eccitazione ed emissione 510-560 572-648. </li><li> Le immagini sono state catturate usando SlideBook 4,2 (Figura 1) </li></ul> 2. Portare le cellule a fuoco con luce bianca. 3. Catturare l'immagine con filtri appropriati per ciascun fluoroforo. Rappresentante Risultati Immagini rappresentative sono (Figura 1). GFP focolai devono essere ben definiti, mentre FM4-64 colorazione deve essere brillante e chiaro 4-7. Immagini GFP o membrana possono essere pseudo-colorato con qualsiasi colore, per consentire la massima qualità dell'immagine che sarà presentato senza perdere alcun dato. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: le immagini GFP Rappresentante di B. subtilis proteine ​​di fusione traslazionale. proteine ​​GFP sono mostrati in verde, mentre FM4-64 membrana colorazione è mostrato in rosso. La barra di scala bianca indica 3 micron (A) muts-GFP [rilevanti genotipo: muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (gatto)]. In presenza di 600 mg / ml 2-aminopurine e 1 mM IPTG. FM4-64 segnale non viene presentato per mostrare più chiaramente le foci muts-GFP (B) MutL-GFP [rilevanti genotipo: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. In presenza di 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [rilevanti genotipo: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) Reca-GFP [rilevanti genotipo: recA:: recA-GFP (SPC)] in presenza di 20 ng / mL mitomicina C. (E) TagC-GFP [rilevanti genotipo: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] in presenza di 1 mg / mL mitomicina C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Trattamento / concentrazione o importo </td><td> Funzione </td><td> Tempo di incubazione </td></tr><tr><td> Mitomicina C (MMC) [20 e 150 ng / ml] </td><td> DNA agente alchilante </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] </td><td> mancata corrispondenza inducendo </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> Idrossiurea (HU) </td><td> esaurisce dNTP </td><td> 3 ore </td></tr><tr><td> luce ultravioletta (UV) 20 J/m2 </td><td> Timina-timina dimeri e 6-4 fotoprodotti </td><td> varia a seconda della fonte, di solito 20 secondi </td></tr><tr><td> grigi (radiazioni ionizzanti) da 5 a 100 Gy </td><td> Rompe doppio filamento, le interruzioni di singolo filamento e siti danno base </td><td> varia a seconda della fonte </td></tr></tbody></table>"&gt; Tabella 1. Sintesi dei trattamenti che danneggiano il DNA e indurre mancata corrispondenza <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Multitest scivolo, 15-oltre </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Pescatore </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Pescatore </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomicina C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutageno, indossare guanti </td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250mg </td><td> guanti </td></tr><tr><td> Idrossiurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> guanti </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensibile alla luce </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Lista dei reagenti e attrezzature specifiche:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Tentativi ed errori sono necessari per trovare condizioni di esposizione per immagini di altissima qualità per ogni ceppo, troviamo che 1 millisecondo è appropriato per le immagini a luce bianca, mentre l&#39;esposizione da 100 a 2000 ms sono appropriati per GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) le immagini. Tempo di esposizione variano a seconda delle apparecchiature di imaging utilizzate. Si consiglia l&#39;uso di un ceppo per 15 pozzetti vetrino da microscopio per il più semplice di imaging, come la qualità pad e la diffusion...

Ricette soluzione specifica 1: S7 10x 50 sali 0,5 M MOPS 100 mM di solfato di ammonio 50 mM di potassio fosfato monobasico Filtro sterilizzare, e avvolgere S7 50 supporti in fogli prima di stoccaggio Metalli 100x 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0.1 mM ZnCl 2 100 mg / ml tiamina HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl 3 * dH 2 O a volume finale * FeCl 3 deve essere aggiunto all&#39;ultimo, per evitare la precipitazione. Dopo la sterilizzazione del filtro, avvolgere 100x soluzione in un foglio di metallo. S7 50 mezzi 1x S7 50 sali 1x metallo 1% di glucosio 0,1% glutammato 40 mcg / mL triptofano 40 mcg / mL Fenilalanina H 2 O distillata a volume finale Spizizens 10x (grammi / L) 151,4 solfato di ammonio mM (20 g / L) 803,8 mM di potassio fosfato monobasico (140 g / L) 440,9 mM di potassio fosfato bibasico (60g / L) 34,0 mM citrato di sodio (10 g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / L) dH 2 O a volume finale Filtro sterilizzare

imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del dna in bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Sia procarioti ed eucarioti rispondere a danni al DNA attraverso una complessa serie di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell&#39;espressione genica, la redistribuzione delle proteine ​​esistenti e l&#39;assemblaggio di complessi proteici nuovo può essere stimolata da una varietà di lesioni del DNA e non corrispondenti coppie di basi del DNA. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato come un potente strumento sperimentale per visualizzare e quantificare le risposte a queste ed altre lesioni del DNA e per monitorare lo stato replicazione del DNA all&#39;interno della complessa architettura subcellulare di una cellula vivente. Fusioni traduzionali tra proteine ​​fluorescenti giornalista e componenti della replicazione del DNA e riparazione macchinari sono stati utilizzati per determinare i segnali che l&#39;obiettivo del DNA proteine ​​di riparazione delle lesioni ai loro affini<em&gt; In vivo</em&gt; E per capire come queste proteine ​​sono organizzati all&#39;interno delle cellule batteriche. Inoltre, fusioni trascrizionale e traslazionale legata ai promotori inducibili danni al DNA hanno rivelato che le cellule all&#39;interno di una popolazione hanno attivato le risposte allo stress genotossico. In questa recensione, forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di microscopia a fluorescenza per l&#39;immagine del montaggio di riparazione del DNA e complessi di replicazione del DNA in singole cellule batteriche. In particolare, questo lavoro si concentra sulle proteine ​​mancata corrispondenza riparazione di imaging, ricombinazione omologa, replicazione del DNA e un SOS-inducibile proteina<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Tutte le procedure descritte qui sono facilmente suscettibili di complessi proteici di imaging in una varietà di specie batteriche.

Un protocollo dettagliato è descritto per l&#39;imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Cellule.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Sia i procarioti che gli eucarioti rispondono al danno al DNA attraverso un complesso insieme di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell'espressione genica, la ridistribuzione...

Stirpi TLU di Baus contenenti fusioni traduzionali di riparazione degli appaiamenti. Le proteine fuse a GFP vengono seminate su terreno selettivo. Le cellule della linea vengono utilizzate come inocolo fresco per colture liquide.Le cellule vengono coltivate fino a quando l'OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,4, momento in cui vengono applicati i trattamenti induttori di disallineamento per il tempo desiderato, e le cellule vengono fatte crescere ulteriormente fino a raggiungere un OD 600 compreso tra 0,5 e 0,8, dopodiché vengono raccolte. Il colorante per le membrane FM 4-64 viene aggiunto se desiderato, e le cellule vengono depositate su vetrini con cuscinetti di agarosio preparati, lasciate sedimentare dopo aver rimosso l'eccesso di mezzo. Per aspirazione.Viene applicata una lamella e le cellule vengono visualizzate mediante microscopia. Salve, sono il dottor Andrew Kow del laboratorio del dottor Lyle Simmons del Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo dell'Università del Michigan di Ann Arbor. Oggi vi mostreremo un procedimento utilizzato per visualizzare fusioni traduzionali delle proteine di riparazione degli errori nell'appaiamento del DNA, nonché altre proteine di riparazione e ribosomiali in Bacillus solus.Utilizziamo questa procedura per studiare l'interazione tra le proteine del sistema di riparo delle eteroduplicazioni del DNA e le proteine ribosomiali in cellule vive di bacillus subtiles. Cominciamo. Per iniziare questa procedura, preparare i ceppi B sublist contenenti la proteina di fusione traduzionale che si desidera visualizzare per alcuni ceppi.È sufficiente iniziare un giorno prima dell'acquisizione delle immagini. Esempi di ceppi di questo tipo includono quelli che crescono bene quando la fusione traduttiva tra GFP e il gene di interesse viene inserita nel locus endogeno del gene, come MU LGFP. Quando si inizia un giorno prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzare un'ansa sterile in condizioni asettiche per applicare i batteri su terreno solido LB selettivo in piastra.Per ottenere colonie singole, incubare per tutta la notte a 30 gradi Celsius; il giorno successivo, le colonie verranno utilizzate come inocolo iniziale. Alcuni ceppi di B. subtilis richiedono due giorni di crescita prima della microscopia per ottenere immagini di alta qualità. I ceppi specifici che richiedono una crescita di due giorni sono quelli che crescono male a causa della fusione traduttiva, come recA-GFP; nel primo giorno, stendere i batteri su LB selettivo con AED e incubare per tutta la notte.Nel secondo giorno, eseguire un'analisi per diluizioni seriali. Innanzitutto, scegliere una singola colonia per inoculare 100 microlitri di soluzione salina allo 0,85%, quindi effettuare quattro diluizioni seriali di ordine decimale. Piastrare 100 microlitri di ciascuna diluizione salina, nonché della colonia iniziale e della soluzione salina, su terreni LB solidificati contenenti antibiotici selettivi. Incubare le piastre durante la notte, generalmente a 30 gradi Celsius, dopo la seconda incubazione notturna. Selezionare la piastra di diluizione che presenta una crescita cellulare leggermente confluenziale.Questi forniscono un innesco di partenza sano e in crescita esponenziale, che potenzialmente consente di ottenere eccellenti risultati di imaging. Questo è particolarmente utile per l’imaging di massima qualità della colorazione delle membrane. Al mattino dell’imaging, con FM 4-64, versare 10 millilitri di mezzo S750 in un matraccio sterile da 125 millilitri.Pertanto, mantenere almeno un rapporto aria-mezzo pari a dieci volte. Risospendere le cellule in fino a due millilitri di mezzo S750 proveniente dal lppl con colonie singole o cellule a confluenza simile per ottenere un inocolo. Aggiungere una quantità sufficiente di inocolo cellulare in mezzo S750 nel matraccio Erlenmeyer contenente 10 millilitri di mezzo S750 in modo che la coltura abbia un OD600 iniziale di circa 0,08–0,1.Successivamente, coltivare ciascuna coltura alla temperatura appropriata affinché il ceppo B della lista di addestramento possa essere immaginato. Si preferiscono bagni termostatati con agitazione rotatoria compresa tra 150 e 200 giri al minuto. Continuare la crescita delle colture fino a quando non raggiungono un OD 600 di circa 0.5-0.8.Per colture trattate con agenti che provocano danni al DNA o induttori di errori di appaiamento, pianificare il trattamento in modo che la fine del periodo di incubazione con l'agente modificatore del DNA coincida con il momento in cui si raggiunge l'OD 600 desiderato. Ad esempio, la due amino purina, un analogo del DNA che imita una base malappaiata quando incorporata nel genoma, richiede un'incubazione di un'ora e induce la formazione di foci di proteine di riparo degli errori di appaiamento, come mut LGFP. Tuttavia, la formazione di foci REC A GFP richiede un'incubazione di un'ora con mitomicina C o un altro reagente che causa danni al DNA, al fine di indurre rotture del doppio filamento; sia la due amino purina che la mitomicina C vengono aggiunte.Quando le colture raggiungono un OD 600 di circa 0,3-0,4 e dopo l'ora necessaria di crescita con il trattamento previsto, le colture avranno probabilmente raggiunto un OD 600 compreso tra 0,5 e 0,8 e saranno pronte per l'acquisizione delle immagini. Iniziare pipettando 300 microlitri di cellule in coltura in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Se si desidera ottenere un'immagine delle membrane cellulari con una diluizione 1:1000 di un milligrammo per millilitro del colorante per membrane FM 4 64, potrebbe essere necessaria una titolazione del FM 4 64 per ottenere il segnale di fluorescenza desiderato.Un intervallo tipico di titolazione è da uno a 100, da uno a 1001 a 10.000. Lasciare i campioni a riposo fino a 10 minuti o per il tempo necessario alla preparazione del vetrino. Se è richiesta la concentrazione delle cellule, filtrare le cellule utilizzando un filtro da 0,2 micrometri con un apparato a vuoto.Quindi lavare delicatamente le cellule dal filtro con un tampone o mezzo appropriato mentre i campioni cellulari sono in incubazione con FM 4-64. Preparare l'agarosio all'1% con un x zens aggiungendo cinque millilitri di soluzione madre 10 x zens a 45 millilitri di acqua distillata insieme a 0,5 grammi di agrosio e riscaldando al microonde per far sciogliere.Lasciare che la temperatura degli aros si equilibri in un bagno d'acqua a circa 65 gradi Celsius e aspirare 20 microlitri di specie. Terminare con l'1% di aros fuso in una punta di pipetta. Gli aros troppo caldi sono difficili da pipettare, mentre gli aros freddi si solidificheranno e non entreranno nella punta della pipetta.Successivamente, utilizzare una lamella multitest da 15 pozzetti e pipettare una singola goccia di circa uno-due microlitri della soluzione di aros in ciascun pozzetto della lamella per formare dei pad sottili di aros, che solidificheranno immediatamente.I vetrini vengono preparati immediatamente prima dell'applicazione delle cellule per evitare la disidratazione, che renderebbe i vetrini inutilizzabili. I cuscinetti aros devono essere centrati e riempire ogni pozzetto, ma con altezza minima per evitare di interferire con il coprioggetto. Se le gocce sono troppo alte, presentano bolle o se il campione si espande oltre il bordo del pozzetto, è sufficiente pulire il pozzetto con un fazzoletto di carta kim e applicare un nuovo cuscinetto aros.Ora che il vetrino è pronto, applicare l'intero campione di 300 microlitri precedentemente messo da parte nel tubo da microcentrifuga sul vetrino, distribuendo il campione sulla parte superiore di ciascun tampone aeros. Questa quantità di cellule dovrebbe essere sufficiente a coprire ciascun pozzetto del vetrino. Lasciare il vetrino caricato con le cellule a temperatura ambiente per circa 10 minuti.Questo passaggio permetterà alle cellule di depositarsi sul tampone di agarosio e di immobilizzarsi, risultando così pronte per l'acquisizione delle immagini al termine dell'incubazione di 10 minuti. Aspirare il mezzo in eccesso da ogni pozzetto senza rimuovere i tamponi stessi. Applicare il coprioggetto al vetrino premendo con fermezza e uniformità, ma con delicatezza, su tutta la superficie del vetrino; verificare che il coprioggetto sia ben aderente al vetrino e che non sia sollevato rispetto ad esso.Procedere all’imaging: molti diversi microscopi a fluorescenza funzioneranno bene. È fondamentale disporre di un obiettivo ad immersione in olio da 100x. Il laboratorio Simmons utilizza un microscopio Olympus BX 61 dotato di obiettivo ad immersione in olio da 100x con apertura numerica 1,45, adatto per microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna o per turf m.Il microscopio è inoltre dotato di una telecamera CCD raffreddata e di una sorgente luminosa a metallo arco LU 200. Iniziare mettendo a fuoco le cellule utilizzando la luce bianca. Utilizzare il filtro appropriato per ogni tipo di flora.Quattro per la rilevazione di GFP. Utilizzare un filtro di eccitazione da 460 a 500 e un filtro di emissione da 510 a 560 per la rilevazione di FM 4-64. Utilizzare un filtro di eccitazione da 510 a 560 e un filtro di emissione da 572 a 648.Acquisire l'immagine utilizzando i filtri appropriati per ogni piano. Quattro con il software Slide Book 4.2. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi dell'immagine del protein della riparazione degli errori di appaiamento del DNA, MUL, che è stato fuso in modo traduttivo a GFP.La coltura di controllo non trattata di MU LGFP mostra foci minimi, con la maggior parte delle cellule che contiene solo livelli citoplasmatici della proteina di fusione mut LGFP. Tuttavia, la maggior parte delle cellule cresciute in presenza di due amino purina, che imita una base appaiata in modo errato quando incorporata nel genoma, presenta foci GFP, indicando che la proteina mutal GFP è coinvolta nel riconoscimento e nella riparazione delle basi del DNA appaiate in modo errato.Si ottengono risultati simili con il ceppo REC A GFP coltivato in presenza del farmaco induttore di danni al DNA, mitomicina C. In questo caso, la maggior parte delle cellule contiene un focolaio di rec A GFP dopo il trattamento con mitomicina C, indicando che rec A GFP ha risposto al danno al DNA avviando il processo di riparazione, a differenza del caso senza trattamento con mitomicina C in cui si osserva pho IR. Vi abbiamo appena mostrato come visualizzare le proteine di riparazione in cellule vive di facius subtlest. Quando si esegue questa procedura.È importante ricordare di prendersi il tempo necessario e di mettere le cellule a fuoco correttamente, il che potrebbe richiedere un po' di pratica. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

Scopri come visualizzare in tempo reale la formazione dei complessi di riparazione del DNA in Bacillus subtilis utilizzando fusioni proteiche con GFP. Questo metodo avanzato permette di studiare la dinamica della riparazione degli errori di accoppiamento nelle cellule viventi.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis

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