Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Ciao, sono Ham del laboratorio del Dr.Review Klar presso il dipartimento di neurobiologia medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Ciao, sono Sophie Esman e vengo anche da un laboratorio Lars. Oggi vi mostreremo una procedura per Innovo, l'elettroporazione e la preparazione del libro aperto del midollo spinale.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le traiettorie assonali della popolazione neuronale geneticamente definita nel midollo spinale embrionale. Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, trasferisci le uova di gallina bianca livornese fecondate da una temperatura ambiente a un'incubatrice umidificata, preferibilmente con vassoi a dondolo a 37-38 gradi Celsius.

È importante monitorare la temperatura e l'umidità dell'incubatrice per ottenere embrioni vitali e sincronizzati. Gli embrioni di pollo vengono elettroporati quando hanno raggiunto l'hamburger e lo stadio di Hamilton o HH da 18 a 20, che è uno stadio ottimale per l'espressione specifica della dipendenza da potenziatori. In questa fase, la testa si trova ad angolo retto rispetto al tronco.

Anche allo stadio HH da 18 a 20, dovrebbe essere visibile anche una vasta serie di vasi sanguigni extra embrionali come i vasi della linea vitale anteriore, posteriore destra e sinistra. Gli embrioni di pollo raggiungono lo stadio HH da 19 a 20 dopo 66 ore di incubazione, e a quel punto rimuovono le uova dall'incubatrice Dopo aver rimosso le uova, posizionarle orizzontalmente e attendere da cinque a 10 minuti. L'embrione si trova ora al polo superiore dell'uovo.

Prima dell'elettrostimolazione, gli embrioni preparano la soluzione di Hank con 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina. Preparare la miscela desiderata di DNA da due a cinque microgrammi per microlitro e aggiungere alcuni grani del colorante verde veloce per una facile visualizzazione del DNA iniettato. Tieni a portata di mano anche una pipetta per la bocca, un ago per siringa sterile, piccole forbici e un nastro adesivo.

Preparare i micro capillari tirando capillari di vetro di 0,5 millimetri di diametro con un estrattore per pipette. Posizionare gli elettrodi di tungsteno nei micromanipolatori e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Impostare la tensione sul generatore di impulsi a meno 30 volt, la lunghezza di ciascun impulso a 50 millisecondi e il numero di impulsi a tre.

Procedere all'elettroporazione prima di esporre e maneggiare gli embrioni. Inserisci una siringa sul polo stretto dell'uovo e rimuovi da cinque a sei millilitri di albumina da ogni uovo. L'albumina viene rimossa per evitare che fuoriesca.

Quando si taglia nel passaggio successivo, utilizzare le forbici piccole per tagliare. Apri una finestra ovale nella parte superiore dell'uovo dopo aver rivelato l'embrione di pollo, inumidiscilo con 0,5-1 millilitri di matasse e una soluzione di penicillina streptomicina. Quindi, utilizzare un perpet a bocca per caricare il micro capillare in vetro.

Con una miscela di coloranti al DNA, un micro capillare del diametro corretto dovrebbe caricarsi facilmente con il DNA. In posizione binoculare l'embrione per iniettare il DNA nel tubo neurale. Posiziona l'embrione con la coda rivolta verso di te.

In questa fase dello sviluppo, il midollo spinale è chiaramente visibile e quindi non sono necessarie tecniche di contrasto. Il midollo spinale è sigillato sia all'estremità della testa che a quella della coda. Tuttavia, con il micro capillare che perfora più fori nel tubo neurale e lo penetra con un angolo poco profondo, un micro capillare abbastanza sottile e del diametro corretto dovrebbe penetrare nel tubo senza danneggiarlo.

Iniettare il DNA usando un perpet per bocca. Un micro capillare del diametro corretto dovrebbe rilasciare il DNA con un'espirazione regolare. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole del cervello in via di sviluppo.

Iniettare fino a quando il tubo neurale non è pieno di DNA, è necessaria l'elettroporazione affinché il DNA iniettato entri prima nelle cellule. Posizionare gli elettrodi in parallelo al tubo neurale e il più vicino possibile ad esso senza toccare il tubo stesso. Assicurarsi che gli elettrodi siano ricoperti di liquido per consentire la conduttività elettrica durante l'impulso.

Di solito la soluzione di Hank aggiunta subito dopo aver esposto l'embrione è sufficiente. Ma se non una goccia della soluzione di Hank appena prima dell'impulso con gli elettrodi posizionati e immersi nell'impulso liquido per azionare l'elettro, rimuovere con cura gli elettrodi e sigillare la finestra e l'uovo con del nastro adesivo. È importante sigillare completamente l'ovulo per evitare l'essiccazione dell'embrione durante il successivo periodo di incubazione.

Rimetti l'uovo nell'incubatrice e incuba fino a quando l'embrione di pollo raggiunge lo sviluppo embrionale. Sei o sesto giorno, quando è il momento dell'imaging quando l'embrione elettroporato ha raggiunto lo sviluppo embrionale. Sei giorni, E sei tre giorni dopo l'elettroporazione, rimuovilo dall'uovo e mettilo in una capsula di Petri rivestita di silicone contenente PBS usando le forbici sottili.

Taglia via le membrane e allunga l'embrione sul lato ventrale usando dei perni spinti nel silicone per tenerlo in posizione. Utilizzando un micro capillare di tungsteno affilato. Praticare un'incisione longitudinale lungo la piastra del tetto dal cervello posteriore fino alla coda.

Praticare due incisioni longitudinali aggiuntive su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli della radice dorsale o DRG dal midollo spinale. Staccare la placca del pavimento dal tessuto partendo dalla coda fino al cervello posteriore, lasciando intatto il midollo spinale. Infine, usa le forbici sottili per tagliare il midollo spinale in una sezione trasversale al cervello posteriore e separare il midollo spinale dal corpo.

Ora che il midollo spinale è stato isolato, stendilo in una nuova piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS usando perni per tenerlo dal cervello posteriore alla coda producendo una preparazione a montaggio piatto. Fissare il midollo spinale in paraldeide al 4% in PBS per un'ora a temperatura ambiente con colorazione immunologica seguendo la procedura di immunoistochimica, il protocollo scritto dettagliato e di accompagnamento per montare il midollo spinale aperto. Preparazione del libro per l'imaging.

Stendere il grasso o il silicone a forma di rettangolo su un vetrino e far gocciolare il PBS all'interno del rettangolo. Usa una pinzetta per posizionare il midollo spinale, allunga il centro del rettangolo e tira fuori il liquido attorno ad esso. Con una pasta per animale domestico, posizionare una o due gocce di terreno di montaggio sul midollo spinale e coprire con un vetrino coprioggetto.

Applicare pressione sul vetrino coprioggetto. Per evitare bolle d'aria. Mantieni le diapositive al buio a quattro gradi Celsius.

Ispezionare il midollo spinale utilizzando la microscopia confocale. Ecco alcuni risultati rappresentativi dei rigetti assonali degli interneuroni spinali di pollo in esperimenti di controllo in cui RFP è espresso in tutti i neuroni utilizzando un elemento potenziatore ubiquitario dal CMV, la maggior parte dei neuroni e i loro assoni sono marcati. È impossibile decifrare la traiettoria assonale delle sottopopolazioni neuronali.

Tuttavia, quando si applicano specifici elementi di potenziamento, in questo esempio viene rivelato un percorso assonale definito di una specifica sottopopolazione di due neuroni DI. Quindi vi abbiamo appena mostrato come azionare elettricamente un tubo neurale della guancia con uno specifico potenziatore neuronale a E tre e come preparare un midollo spinale a libro aperto a E sei. Quando esegui questa procedura, dovresti ricordarti di essere attento e paziente.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti. Buona Fortuna.