Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione
May 2nd, 2010
Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino utilizzando In ovo di geni reporter sotto il controllo di specifici elementi enhancer.
Ciao, sono Ham del laboratorio del Dr.Review Klar presso il dipartimento di neurobiologia medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Ciao, sono Sophie Esman e vengo anche da un laboratorio Lars. Oggi vi mostreremo una procedura per Innovo, l'elettroporazione e la preparazione del libro aperto del midollo spinale.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le traiettorie assonali della popolazione neuronale geneticamente definita nel midollo spinale embrionale. Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, trasferisci le uova di gallina bianca livornese fecondate da una temperatura ambiente a un'incubatrice umidificata, preferibilmente con vassoi a dondolo a 37-38 gradi Celsius.
È importante monitorare la temperatura e l'umidità dell'incubatrice per ottenere embrioni vitali e sincronizzati. Gli embrioni di pollo vengono elettroporati quando hanno raggiunto l'hamburger e lo stadio di Hamilton o HH da 18 a 20, che è uno stadio ottimale per l'espressione specifica della dipendenza da potenziatori. In questa fase, la testa si trova ad angolo retto rispetto al tronco.
Anche allo stadio HH da 18 a 20, dovrebbe essere visibile anche una vasta serie di vasi sanguigni extra embrionali come i vasi della linea vitale anteriore, posteriore destra e sinistra. Gli embrioni di pollo raggiungono lo stadio HH da 19 a 20 dopo 66 ore di incubazione, e a quel punto rimuovono le uova dall'incubatrice Dopo aver rimosso le uova, posizionarle orizzontalmente e attendere da cinque a 10 minuti. L'embrione si trova ora al polo superiore dell'uovo.
Prima dell'elettrostimolazione, gli embrioni preparano la soluzione di Hank con 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina. Preparare la miscela desiderata di DNA da due a cinque microgrammi per microlitro e aggiungere alcuni grani del colorante verde veloce per una facile visualizzazione del DNA iniettato. Tieni a portata di mano anche una pipetta per la bocca, un ago per siringa sterile, piccole forbici e un nastro adesivo.
Preparare i micro capillari tirando capillari di vetro di 0,5 millimetri di diametro con un estrattore per pipette. Posizionare gli elettrodi di tungsteno nei micromanipolatori e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Impostare la tensione sul generatore di impulsi a meno 30 volt, la lunghezza di ciascun impulso a 50 millisecondi e il numero di impulsi a tre.
Procedere all'elettroporazione prima di esporre e maneggiare gli embrioni. Inserisci una siringa sul polo stretto dell'uovo e rimuovi da cinque a sei millilitri di albumina da ogni uovo. L'albumina viene rimossa per evitare che fuoriesca.
Quando si taglia nel passaggio successivo, utilizzare le forbici piccole per tagliare. Apri una finestra ovale nella parte superiore dell'uovo dopo aver rivelato l'embrione di pollo, inumidiscilo con 0,5-1 millilitri di matasse e una soluzione di penicillina streptomicina. Quindi, utilizzare un perpet a bocca per caricare il micro capillare in vetro.
Con una miscela di coloranti al DNA, un micro capillare del diametro corretto dovrebbe caricarsi facilmente con il DNA. In posizione binoculare l'embrione per iniettare il DNA nel tubo neurale. Posiziona l'embrione con la coda rivolta verso di te.
In questa fase dello sviluppo, il midollo spinale è chiaramente visibile e quindi non sono necessarie tecniche di contrasto. Il midollo spinale è sigillato sia all'estremità della testa che a quella della coda. Tuttavia, con il micro capillare che perfora più fori nel tubo neurale e lo penetra con un angolo poco profondo, un micro capillare abbastanza sottile e del diametro corretto dovrebbe penetrare nel tubo senza danneggiarlo.
Iniettare il DNA usando un perpet per bocca. Un micro capillare del diametro corretto dovrebbe rilasciare il DNA con un'espirazione regolare. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole del cervello in via di sviluppo.
Iniettare fino a quando il tubo neurale non è pieno di DNA, è necessaria l'elettroporazione affinché il DNA iniettato entri prima nelle cellule. Posizionare gli elettrodi in parallelo al tubo neurale e il più vicino possibile ad esso senza toccare il tubo stesso. Assicurarsi che gli elettrodi siano ricoperti di liquido per consentire la conduttività elettrica durante l'impulso.
Di solito la soluzione di Hank aggiunta subito dopo aver esposto l'embrione è sufficiente. Ma se non una goccia della soluzione di Hank appena prima dell'impulso con gli elettrodi posizionati e immersi nell'impulso liquido per azionare l'elettro, rimuovere con cura gli elettrodi e sigillare la finestra e l'uovo con del nastro adesivo. È importante sigillare completamente l'ovulo per evitare l'essiccazione dell'embrione durante il successivo periodo di incubazione.
Rimetti l'uovo nell'incubatrice e incuba fino a quando l'embrione di pollo raggiunge lo sviluppo embrionale. Sei o sesto giorno, quando è il momento dell'imaging quando l'embrione elettroporato ha raggiunto lo sviluppo embrionale. Sei giorni, E sei tre giorni dopo l'elettroporazione, rimuovilo dall'uovo e mettilo in una capsula di Petri rivestita di silicone contenente PBS usando le forbici sottili.
Taglia via le membrane e allunga l'embrione sul lato ventrale usando dei perni spinti nel silicone per tenerlo in posizione. Utilizzando un micro capillare di tungsteno affilato. Praticare un'incisione longitudinale lungo la piastra del tetto dal cervello posteriore fino alla coda.
Praticare due incisioni longitudinali aggiuntive su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli della radice dorsale o DRG dal midollo spinale. Staccare la placca del pavimento dal tessuto partendo dalla coda fino al cervello posteriore, lasciando intatto il midollo spinale. Infine, usa le forbici sottili per tagliare il midollo spinale in una sezione trasversale al cervello posteriore e separare il midollo spinale dal corpo.
Ora che il midollo spinale è stato isolato, stendilo in una nuova piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS usando perni per tenerlo dal cervello posteriore alla coda producendo una preparazione a montaggio piatto. Fissare il midollo spinale in paraldeide al 4% in PBS per un'ora a temperatura ambiente con colorazione immunologica seguendo la procedura di immunoistochimica, il protocollo scritto dettagliato e di accompagnamento per montare il midollo spinale aperto. Preparazione del libro per l'imaging.
Stendere il grasso o il silicone a forma di rettangolo su un vetrino e far gocciolare il PBS all'interno del rettangolo. Usa una pinzetta per posizionare il midollo spinale, allunga il centro del rettangolo e tira fuori il liquido attorno ad esso. Con una pasta per animale domestico, posizionare una o due gocce di terreno di montaggio sul midollo spinale e coprire con un vetrino coprioggetto.
Applicare pressione sul vetrino coprioggetto. Per evitare bolle d'aria. Mantieni le diapositive al buio a quattro gradi Celsius.
Ispezionare il midollo spinale utilizzando la microscopia confocale. Ecco alcuni risultati rappresentativi dei rigetti assonali degli interneuroni spinali di pollo in esperimenti di controllo in cui RFP è espresso in tutti i neuroni utilizzando un elemento potenziatore ubiquitario dal CMV, la maggior parte dei neuroni e i loro assoni sono marcati. È impossibile decifrare la traiettoria assonale delle sottopopolazioni neuronali.
Tuttavia, quando si applicano specifici elementi di potenziamento, in questo esempio viene rivelato un percorso assonale definito di una specifica sottopopolazione di due neuroni DI. Quindi vi abbiamo appena mostrato come azionare elettricamente un tubo neurale della guancia con uno specifico potenziatore neuronale a E tre e come preparare un midollo spinale a libro aperto a E sei. Quando esegui questa procedura, dovresti ricordarti di essere attento e paziente.
Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti. Buona Fortuna.
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Panoramica
Questo video dimostra una procedura per visualizzare le vie assonali di neuroni geneticamente definiti nel midollo spinale embrionale del pollo utilizzando l'elettroporazione in ovo. Il metodo permette ai ricercatori di studiare efficacemente le traiettorie assonali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia dello sviluppo
- Eletrofisiologia
Contesto
- Comprendere le vie assonali è cruciale per la ricerca in neuroscienza.
- L'elettroporazione in ovo è una tecnica utilizzata per introdurre geni reporter.
- Il midollo spinale embrionale del pollo serve come modello per studiare lo sviluppo neuronale.
- Le popolazioni neuronali geneticamente definite possono fornire informazioni su specifici circuiti neurali.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare le vie assonali nel midollo spinale embrionale.
- Utilizzare l'elettroporazione in ovo per studi sull'espressione genica.
- Migliorare la comprensione dello sviluppo e della connettività neuronale.
Metodi utilizzati
- Trasferire uova di pollo fecondate in un incubatore umidificato.
- Mantenere l'incubazione a 37-38 gradi Celsius.
- Eseguire l'elettroporazione in ovo per introdurre geni reporter.
- Preparare preparazioni a libro aperto del midollo spinale per la visualizzazione.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo delle vie assonali nel midollo spinale.
- Dimostrazione dell'efficacia dell'elettroporazione in ovo.
- Informazioni sulle traiettorie delle popolazioni neuronali geneticamente definite.
- Stabilimento di un metodo affidabile per studiare lo sviluppo neuronale.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienza.
- L'elettroporazione in ovo è efficace per la consegna di geni nei modelli embrionali.
- Comprendere le vie assonali può informare gli studi sulla formazione dei circuiti neurali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
