Name: Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri come visualizzare le vie assonali di neuroni geneticamente definiti nel midollo spinale embrionale di pollo usando l'elettroporazione in ovo. Questo metodo consente di studiare le traiettorie assonali in modo efficace.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni di AK dalla Israel Science Foundation, il ministero israeliano della sanità, e DFG (tedesco Research Foundation).

I. Elettroporazione Uovo di movimentazione <ol><li> Mettere le uova in un set umidificata incubatore a 37-38 ° C, preferibile un incubatore con vassoi a dondolo. </li><li> Embrione sono elettroporate dopo circa 66 ore di incubazione, quando hanno raggiunto Hamburger &amp; Hamilton (HH) stadio 18-20. In questa fase la testa si trova ad angolo retto rispetto al tronco (condizione chiamata cervicale flessione) e una vasta serie di extra-embrionali vasi sanguigni, come anteriore, posteriore, destro e sinistro vene vitellina dovrebbe essere visto. Questa è una fase ottimale per enhancer-dipendente specifica espressione 1,3,4. E &#39;importante monitorare temperatura e umidità dell&#39;incubatore, al fine di ottenere embrioni vitali e sincronizzati. </li><li> Dopo 66 ore di incubazione, togliere le uova dal termostato. Mettere le uova in orizzontale. Attendere 5-10 minuti. L&#39;embrione ora si trova al polo superiore dell&#39;uovo. </li></ol> Preparativi <ol><li> Preparare la soluzione di Hank con penicillina / streptomicina (P / S) (diluizione 1:100). </li><li> Tirare in vetro capillari (0,5 mm di diametro) a microcapillare. </li><li> Posizionare gli elettrodi (tungsteno) in micromanipolatore e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi (ECM 830). </li><li> Regolare il generatore di impulsi con i seguenti parametri: 30v tensione, numero di impulsi - 3, lunghezza dell&#39;impulso di 50 ms. </li><li> Preparare una pipetta a bocca, un ago della siringa e di un nastro. </li><li> Preparare una miscela desiderata di DNA (2-5μg/μl) e aggiungere un colorante Fast Green. </li></ol> Finestre ed elettroporazione <ol><li> Utilizzando una siringa, togliere 5-6 ml di albumina da ogni uovo. </li><li> Con una piccola forbice aperta una finestra ovale sul lato superiore dell&#39;uovo. </li><li> Umida l&#39;embrione con 0,5-1ml di Hank + P / S soluzione. </li><li> Utilizzare una pipetta a bocca, per caricare il vetro microcapillare con la miscela di DNA. </li><li> Posto l&#39;embrione con la coda verso di voi. In questa fase, il midollo spinale degli embrioni è chiaramente visibile. Pertanto, non sono richieste tecniche di contrasto. Il midollo spinale è sigillato alle due estremità, la testa e la coda, ma se il tuo microcapillare è abbastanza sottile, si sarà in grado di perforare un piccolo buco e penetrare il tubo neurale con un angolo basso. Un microcapillare di diametro diritto devono essere caricati facilmente con il DNA, penetrare il tubo senza danneggiarlo e rilasciare il DNA con una espirazione normale. </li><li> Iniettare il DNA usando una pipetta a bocca. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole di sviluppo del cervello. </li><li> Posizionare gli elettrodi in parallelo al tubo neurale, il più vicino possibile, senza toccare il tubo stesso e impulsi. Al momento dell&#39;impulso, gli elettrodi devono essere coperti con il liquido per consentire la conducibilità elettrica. Di solito, la quantità di Hank aggiunto a chiedere l&#39;elemosina è sufficiente. Se non aggiungere una goccia di Hank appena prima del polso. </li><li> Rimuovere con attenzione gli elettrodi e sigillare la finestra con un nastro. E &#39;importante per sigillare l&#39;uovo interamente contro l&#39;essiccamento della dell&#39;embrione durante il periodo di incubazione successivo. </li><li> Posizionare la parte posteriore uova nell&#39;incubatrice. </li></ol> II. Midollo spinale libro aperto preparazione Distacco del midollo spinale dall&#39;embrione <ol><li> Rimuovere l&#39;embrione eletroporated, a E6, da l&#39;uovo e metterlo in una capsula di Petri rivestito con silicone contenente PBS. </li><li> Tagliare le membrane e allungare l&#39;embrione dalla sua parte ventrale mediante perni per tenerlo. </li><li> Utilizzando un tungsteno nitide microcapillare fare una incisione longitudinale lungo la lamiera del tetto, dal romboencefalo fino alla coda. </li><li> Fare un ulteriore due incisioni longitudinali su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli della radice dorsale (DRG) dal midollo spinale. </li><li> Staccare la piastra dal tessuto partendo dalla coda al romboencefalo, lasciando intatto il midollo spinale. </li><li> Tagliare il midollo spinale in una sezione trasversale al romboencefalo con le forbici fine e separato dal corpo. </li></ol> Fissazione <ol><li> Stendere il midollo spinale isolato in un nuovo piatto di Petri rivestito con silicone contenente PBS, con perni di tenerlo, dal romboencefalo alla coda produrre un piano di montaggio preparazione. </li><li> Versare il PBS dal piatto e sostituirlo con 4% paraformaldeide in PBS. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li></ol> Immunoistochimica <ol><li> Trasferire il midollo spinale fisso in una fiala contenente l&#39;anticorpo primario in PBS. </li><li> Incubare con agitazioni delicato per tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Lavare l&#39;anticorpo X5 volte con PBS, ogni lavaggio per 1 ora con agitazioni gentile. </li><li> Aggiungi anticorpo secondario e incubare con agitazioni delicato per tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Lavare l&#39;anticorpo X5 volte con PBS, ognilavaggio per 1 ora con agitazioni gentile. </li></ol> Montaggio libro aperto per l&#39;imaging <ol><li> Macchia di grasso o silicone a forma di rettangolo su un vetrino e flebo PBS all&#39;interno. </li><li> Posizionare il midollo spinale allungato al centro del rettangolo utilizzando una pinzetta e tirare fuori il liquido attorno ad esso con una pipetta Pasteur. </li><li> Luogo 1-2 gocce di mezzo di montaggio sul midollo spinale e coprire con coprioggetto. Squash per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Tenere le diapositive buio a 4 ° C. </li><li> Ispezionare il midollo spinale usando la microscopia confocale. </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

Elettroporazione di DNA plasmidico in embrione di pollo si evolve come una tecnica potente per in vivo espressione ectopica. La combinazione di stimolatori specifici, ed elettroporazione pulcino fornisce uno strumento rapido ed efficace per decifrare le vie assonale di un gruppo di neuroni geneticamente definito 1,3,5. Utilizzando la Cre / loxP ed i sistemi di amplificazione Gal4/UAS può aumentare i livelli e la durata di espressione. Il quadro che emerge è di una divergenza complesso di spunti assonale che n...

decifrare percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale chick utilizzando in ovo elettroporazione

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Impiego di elementi enhancer di guidare l&#39;espressione di geni reporter nei neuroni è un paradigma ampiamente utilizzato per il monitoraggio proiezione assonale. Per il monitoraggio proiezione assonale degli interneuroni spinali nei vertebrati, della linea germinale mirati geni reporter indicazione del tenore simmetria bilaterale. Pertanto, è difficile distinguere tra il ipsi-e contro-lateralmente assoni proiezione. Elettroporazione unilaterale nel tubo neurale pulcino fornisce un mezzo utile per limitare l&#39;espressione di un gene reporter per una parte del sistema nervoso centrale, ed a seguire proiezione assonale su entrambi i lati<sup&gt; 1 ,2-5</sup&gt;. Questo video mostra come gestire prima le uova prima dell&#39;iniezione. In fase HH 18-20, il DNA è iniettato nel livello sacrale del tubo neurale, poi elettrodi di tungsteno sono posti in parallelo per l&#39;embrione e brevi impulsi elettrici vengono somministrati con un generatore di impulsi. L&#39;uovo è sigillato con nastro adesivo e rimesso in un incubatore per un ulteriore sviluppo. Tre giorni dopo (E6) il midollo spinale viene rimosso come un libro aperto preparazione dall&#39;embrione, fissi, e trattati per tutta la colorazione degli anticorpi mount. Il midollo spinale è macchiato montato sulla slitta ed è visualizzato mediante microscopia confocale.

Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino utilizzando<em&gt; In ovo</emElettroporazione&gt; di geni reporter sotto il controllo di specifici elementi enhancer.

Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

L'impiego di elementi enhancer per guidare l'espressione di geni reporter nei neuroni è un paradigma ampiamente utilizzato per il tracciamento delle proiezioni assonali. Per il tracciamento...

Ciao, sono Ham del laboratorio del Dottor Review Klar del dipartimento di neurobiologia medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Ciao, sono Sophie Esman e anch'io provengo da un laboratorio Lars. Oggi vi mostreremo una procedura per l'elettroporazione in vivo e la preparazione del midollo spinale in forma di libro aperto.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le traiettorie assonali di popolazioni neuronali geneticamente definite nel midollo spinale embrionale. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, trasferire uova di pollo white leghorn fecondate da temperatura ambiente a un incubatore umidificato, preferibilmente con vassoi oscillanti, a 37-38 gradi Celsius.È importante monitorare la temperatura e l'umidità dell'incubatrice per ottenere embrioni vitali e sincronizzati. Gli embrioni di pollo vengono elettroporati quando hanno raggiunto lo stadio di Hamburger e Hamilton (HH) da 18 a 20, che rappresenta una fase ottimale per l'espressione specifica dipendente da enhancer. A questo stadio, la testa è disposta ad angolo retto rispetto al tronco.Anche allo stadio HH 18-20, dovrebbero essere visibili un'ampia serie di vasi sanguigni extraembrionali, come i vasi delle linee vitali anteriore, posteriore, destra e sinistra. Gli embrioni di pollo raggiungono lo stadio HH 19-20 dopo 66 ore di incubazione; a quel punto, rimuovere le uova dall'incubatrice. Dopo aver rimosso le uova, posizionarle in orizzontale e attendere da cinque a dieci minuti. L'embrione si trova ora al polo superiore dell'uovo.Prima dell'elettroporazione, preparare gli embrioni in soluzione di Hank contenente 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina. Preparare una miscela desiderata di DNA a due-cinque microgrammi per microlitro e aggiungere alcuni cristalli di colorante verde brillante per facilitare la visualizzazione del DNA iniettato. Avere a disposizione una pipetta a bocca, un ago sterile per siringa, forbici piccole e del nastro adesivo.Preparare le micropipette tirando capillari di vetro con diametro di 0,5 millimetri mediante un estrattore di pipette. Inserire gli elettrodi al tungsteno nei micromanipolatori e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Impostare la tensione del generatore di impulsi a meno 30 volt, la durata di ciascun impulso a 50 millisecondi e il numero di impulsi a tre.Procedere all'elettroporazione prima di esporre e manipolare gli embrioni. Inserire una siringa al polo stretto dell'uovo ed estrarre da cinque a sei millilitri di albume da ciascun uovo. L'albume viene rimosso per evitare che fuoriesca.Nel passaggio successivo, durante il taglio, utilizzare le forbici piccole per effettuare il taglio. Aprire una finestra ovale nella parte superiore dell'uovo dopo aver esposto l'embrione di pulcino e inumidirlo con 0,5-1 millilitro di soluzione di Hank contenente penicillina e streptomicina. Successivamente, utilizzare un pipetto a bocca per caricare la microcapillare di vetro.Con una miscela di colorante per DNA, una microcapillare del diametro corretto dovrebbe caricarsi facilmente con il DNA. In posizione binoculare, posizionare l'embrione per iniettare il DNA nel tubo neurale. Posizionare l'embrione con la coda rivolta verso di voi.In questa fase dello sviluppo, il midollo spinale è chiaramente visibile e pertanto non sono necessarie tecniche di contrasto. Il midollo spinale è chiuso sia all'estremità cranica che caudale. Tuttavia, praticando fori con microcapillari nel tubo neurale e penetrando con un angolo leggermente obliquo, una microcapillare sufficientemente sottile e del diametro corretto dovrebbe penetrare nel tubo senza danneggiarlo.Iniettare il DNA utilizzando una pipetta a bocca. Una microcapillare del diametro corretto dovrebbe rilasciare il DNA con un'espirazione regolare. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole del cervello in via di sviluppo.Iniettare fino a quando il tubo neurale non sarà riempito con il DNA. L'elettroporazione è necessaria affinché il DNA iniettato entri nelle cellule. Posizionare prima gli elettrodi in parallelo rispetto al tubo neurale e il più vicino possibile a esso, senza toccare direttamente il tubo. Assicurarsi che gli elettrodi siano ricoperti di liquido per permettere la conduzione elettrica durante l'impulso.Di solito, la soluzione di Hank aggiunta immediatamente dopo l'esposizione dell'embrione è sufficiente. Tuttavia, se necessario, aggiungere una goccia di soluzione di Hank poco prima dell'impulso, con gli elettrodi posizionati e immersi nel liquido, quindi applicare l'impulso elettroporativo. Successivamente, rimuovere con attenzione gli elettrodi e sigillare la finestra e l'uovo con del nastro adesivo. È importante sigillare completamente l'uovo per prevenire l'essiccamento dell'embrione durante il successivo periodo di incubazione.Rimettere l'uovo nell'incubatrice e proseguire l'incubazione fino a quando l'embrione del pulcino raggiunge il sesto giorno embrionale di sviluppo, o E6, momento in cui è possibile procedere con l'acquisizione delle immagini. Quando l'embrione elettroporato ha raggiunto il sesto giorno embrionale di sviluppo, E6, tre giorni dopo l'elettroporazione, rimuoverlo dall'uovo e trasferirlo in una piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS, utilizzando forbici fini.Rimuovere le membrane e distendere l'embrione sul suo lato ventrale utilizzando perni inseriti nella silicone per mantenerlo in posizione. Utilizzando una microcapillare affilata al tungsteno, effettuare un'incisione longitudinale lungo la lamina tettoica, dal cervelletto fino alla coda.Eseguire due ulteriori incisioni longitudinali su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli delle radici dorsali o DRG dal midollo spinale. Staccare la lamina del pavimento dal tessuto partendo dalla coda fino al romboencefalo, lasciando il midollo spinale intatto. Infine, utilizzare forbici fini per tagliare trasversalmente il midollo spinale a livello del romboencefalo e separare il midollo spinale dal corpo.Ora che il midollo spinale è stato isolato, distenderlo in una nuova piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS, utilizzando dei perni per fissarlo dal cervello posteriore fino alla coda, ottenendo così una preparazione in montaggio piatto. Fissare il midollo spiniale con paraformaldeide al 4% in PBS per un'ora a temperatura ambiente, quindi procedere alla colorazione immunoistochimica seguendo la procedura descritta nel protocollo scritto allegato, per montare il midollo spinale aperto. Preparare il campione per l'acquisizione delle immagini.Spalmare del grasso o silicone a forma di rettangolo su un vetrino e far cadere al suo interno del PBS. Utilizzare pinzette per posizionare il midollo spinale, distendendolo al centro del rettangolo, ed asportare il liquido circostante. Con una pipetta Pasteur, applicare una o due gocce di mezzo di montaggio sul midollo spinale e coprire con un coprioggetto.Applicare pressione sul vetrino coprioggetto. Per evitare bolle d'aria. Conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius.Esaminare il midollo spinale utilizzando la microscopia confocale. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi di rigetti assonali di interneuroni spinali di pollo in esperimenti di controllo in cui la RFP è espressa in tutti i neuroni mediante un elemento enhancer ubiquitario del CMV: la maggior parte dei neuroni e dei loro assoni risulta marcata. È impossibile decifrare il tragitto assonale di sottopopolazioni neuronali.Tuttavia, applicando elementi miglioratori specifici, viene rivelato un preciso tragitto assonale di una sottopopolazione specifica di due neuroni in questo esempio. Abbiamo appena mostrato come eseguire un'elettroporazione del tubo neurale della guancia con un miglioratore neuronale specifico all'E tre e come preparare un midollo spinale in forma di libro aperto all'E sei. Quando si esegue questa procedura, è necessario ricordare di essere accurati e pazienti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Buona fortuna.

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