Name: Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Impara l'isolamento di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per studi di biologia vascolare e angiogenesi. Questo protocollo utilizza collagenasi e soluzioni bilanciate per ottenere cellule vitali.

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Procedura <ol><li> Posare il cavo sul pad pulito e fuori tamponare il sangue in eccesso. Effettuare tagli freschi su entrambe le estremità del cavo. </li><li> Inserire 21 1 / 2 aghi G con la guaina di plastica ago ON, nella vena. (La vena è la più grande apertura, i 2 più piccoli sono arterie) </li><li> Morsetto l&#39;ago in posizione con un hemostat e collegare la siringa 20cc di Hanks all&#39;ago. </li><li> Spingere il Hanks attraverso la vena con una pressione moderata. Raccogliere i rifiuti nel bicchiere con la candeggina. (Tenendo l&#39;ago e il cavo con una mano mentre si spinge impedirebbe l&#39;ago saltar fuori della vena.) Se c&#39;è un sacco di sangue in vena, lavare una seconda volta. </li><li> Posare il cavo sul pad e pinza l&#39;altra estremità della vena. Riempire con alcuni ml di Hanks per controllare eventuali perdite lungo il cavo. Ritirare i 5 ml e scollegare il morsetto in basso. </li><li> Staccare la siringa 20cc. Togliere lo stantuffo dalla siringa 10cc. Collegare l&#39;ago di siringa 10cc, versare 10 ml collagenasi e sostituire pistone. Spingere collagenasi in vena fino a vedere l&#39;ammontare prima uscita l&#39;estremità aperta. Re-clamp l&#39;estremità aperta e riempire con collagenasi finché non ci sarà moderata distensione della vena. Risultati distensione troppo contaminazione muscolatura liscia. </li><li> Massaggiare delicatamente il cavo. </li><li> Cavo di incubare (con hemostats, aghi e siringhe in allegato) in DPBS a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Durante l&#39;incubazione, continuano le operazioni 1-8 con 2 ° cavo. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, prendere il cavo di coppa e tenendo il cavo sul tubo 50mL tagliare l&#39;estremità sopra il morsetto in basso. Assicuratevi di raccogliere tutto il tubo. Spingere la collagenasi rimanenti attraverso il cavo, quindi collegare la siringa 20cc e spingere attraverso Hanks con una pressione moderata. </li><li> Se non le cellule muscolari lisce sono necessari, eliminare il cavo in questo momento. In caso contrario, inserire il cavo stesso in una seconda 50mL tubo con collagenasi ~ 5 ml ed incubare a 37 ° C per 30-60 minuti. </li><li> Tenere il tubo fino a quando tutti i cavi sono fatti. </li><li> Spin tubi a ~ 1200 rpm per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante (tranne che per ~ 1-2 ml). Risospendere il pellet in 5mls PHEC + e piastra in un T25. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 durante la notte. </li><li> Il giorno dopo togliere il surnatante e sostituirlo con mezzi freschi. Se ci sono molti globuli rossi, lavare una volta con M199, quindi aggiungere + PHEC. Continua l&#39;incubazione, come al solito fino a quando la piastra è confluente (1-4 giorni). Suddiviso in gelatinizzati T75. </li><li> Una volta T75 è confluente, diviso in tre T75s. Congelare due fiale per ogni pallone. </li></ol> Nota: le cellule endoteliali (disattivo) hanno un aspetto acciottolato. Le cellule endoteliali sono a volte attivati ​​(lungo e appuntito) subito dopo l&#39;isolamento, dopo un paio di passaggi che di solito ritornare in uno stato non attive. Pulizia <ol><li> Con molta attenzione, smaltire in un contenitore di aghi acuminati. </li><li> Smaltire le siringhe in grandi contenitori a rischio biologico. </li><li> Mettere tutto il tessuto in piccoli sacchetto. Borsa stretta e congelare a -20 ° fino a quando l&#39;incenerimento. </li><li> Immergere tutti gli strumenti in virucida per almeno 10 min. </li><li> Aggiungi mezzi di incubazione di rifiuti / candeggina bicchiere. Lasciate riposare per almeno 10 min. </li><li> Eliminare il pad in panchina rifiuti biologici. </li><li> Spruzzare verso il basso all&#39;interno e all&#39;esterno di bicchieri, da banco e il coperchio bagnomaria con vircide. Lasciate riposare 10 minuti, quindi pulire. </li><li> Lavare bicchieri e gli strumenti con acqua calda e appendere ad asciugare su rack (macchia fuori gli strumenti in modo che non ruggine). </li><li> Smaltire i rifiuti decontaminati nel lavandino. </li><li> Ritorna supporti non utilizzati per frigorifero. </li><li> Smaltire i guanti in rifiuti biologici. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Collagenasi 0,1%</td><td></td><td></td><td>10 mL per cordone, riscaldati a 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari</td><td></td><td></td><td>T75, uno per cordone.</td></tr><tr><td>Mezzo di Hank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forbici</td><td></td><td></td><td>sterili</td></tr><tr><td>bicchiere</td><td></td><td></td><td>sterile</td></tr><tr><td>tubi da 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

L&#39;angiogenesi è un complesso processo multi-step, in cui in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l&#39;allineamento della CE in corde, formazione lumen, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell&#39;angiogenesi, e morfologicamente i vasi spesso non assomigliano vasi in vivo. Qui mostriamo uno ottimizzato test in vitro che utilizza l&#39;angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi iniziali della chiave dell&#39;angiogenesi, e soprattutto i vasi visualizzazione lumen brevetto intercellulare circondato da polarizzata CE. Le navi possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse, e recuperato in forma pura per applicazioni a valle.

Questo protocollo video illustra l&#39;isolamento e la coltura di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) da cordone ombelicale umano. Una volta isolato queste cellule possono essere utilizzati per test in vitro angiogenesi come il saggio Ottimizzato fibrina Gel Bead dimostrata anche dal laboratorio di Hughes.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

L'angiogenesi è un complesso processo multistadio in cui, in risposta a stimoli angiogenici, nuovi vasi vengono creati a partire dalla vascolarizzazione esistente. Questi passaggi...

Ciao, mi chiamo Jager Davis e oggi vi mostrerò come isolare le cellule endoteliali della vena ombelicale umana, note anche come ic. Utilizzeremo diversi mezzi, partendo dalla soluzione salina equilibrata di Hank, che servirà a pulire le nostre cellule da globuli rossi o altre contaminazioni presenti nella vena. In secondo luogo, useremo la collagenasi risospesa in DPBS, una soluzione che verrà impiegata per staccare le ubic dalla vena; quindi le semineremo in un mezzo con effetto al 20%, costituito da M1 99 arricchito con FBS attivato termicamente e soluzione pen stripp.Aggiungeremo anche un integratore per la crescita delle cellule endoteliali della BD Biosciences alla nostra sospensione Resus. Bene, ho un paio di forbici da dissezione. Eseguirò un taglio dritto attraverso il cordone in questo modo.Successivamente, procederò a pulire il cordone. Quindi, identificherò le arterie e la vena. Ci sono due arterie e una vena.Di solito identifico le arterie a due a due. Escono verso di voi. Quindi ne abbiamo una proprio qui e un'altra arteria proprio qui.E come puoi vedere, la vena entra effettivamente nel cordone, ed è proprio qui che posizioneremo il nostro ago a farfalla. Stiamo utilizzando un ago a farfalla Accutane da 21 gauge e tre quarti di pollice. Quindi, aprilo.Entrerò proprio così. Ancora una volta, identificherò le arterie. Abbiamo un'arteria e la seconda arteria, e poi c'è la nostra vena.Prenderò quindi l'ago a farfalla e lo inserirò nella vena molto delicatamente, ma potreste incontrare una certa resistenza. Io preferisco ruotare leggermente il cordone mentre spingo contemporaneamente l'ago, con un movimento di questo tipo, e continuare finché le alette dell'ago a farfalla non sono perfettamente allineate con il cordone, proprio così. A questo punto siamo pronti, possiamo procedere e chiudere il morsetto.Quello che farò ora è riempire due siringhe da 20 ml con 20 ml di inchiostro ciascuna. Successivamente, riempirò una provetta conica da 50 ml con 5 ml di effetto al 20%. Poi preleverò con la pipetta 10 ml di DPBS e li trasferirò in una delle provette coniche da 15 ml.Quindi, in questi 15 ml di DPBS, aggiungerò 10 milligrammi della nostra polvere di collagenasi, che peserò su una bilancia. Procederò a risospendere la collagenasi semplicemente capovolgendo il tubo alcune volte, fino a quando la polvere si sarà staccata dalle pareti del tubo. Dopo circa cinque o sei capovolgimenti, filtrerò in modo sterile la collagenasi utilizzando una siringa da 10 ml per aggiungere il filtro.E ora siamo pronti a far passare questi mezzi attraverso il cordone. Quello che ho fatto è versare il DPPS rimanente in questo becher da un litro, e lo collocherò nel bagnomaria a 37 gradi per farlo riscaldare. Questo verrà utilizzato per incubare il nostro cordone per circa 15 minuti.Questa è la nostra soluzione di collaghenasi filtrata. Posizionerò questa provetta conica nel bagnomaria a 37 gradi, permettendole di scaldarsi, e la utilizzerò in seguito durante la procedura per staccare l'uvea dall'interno della nostra vena. Quindi, ciò che farò ora è clampare il cordone nel punto dell'ago farfalla e far scorrere 20 ml di Hanks attraverso il cordone per eliminare eventuali cellule sanguigne.Dopo aver fissato l'ago farfalla, spingerò attraverso 20 ml del nostro hanks. Farò questo molto lentamente per prevenire qualsiasi rottura della vena. Questa è all'incirca la velocità con cui si desidera che fuoriesca, ma non si vuole far scorrere il hanks in un getto continuo.Questo significa che la stai spingendo troppo intensamente. Di solito lo faccio, sai, goccia a goccia. E ancora, spingo le ciocche attraverso la vena per pulirla bene.E si espongono le nostre cellule terminali. Dopodiché, abbiamo fatto passare tutti i nostri appesi. Procederò ora a posare il cordone e, successivamente, clampizzerò l'estremità inferiore del cordone, rimuoverò la siringa e la sistemerò in un sacchetto per rifiuti biologici.Successivamente, aggancerò una nuova siringa da 10 mil. Bene, ora spingerò la collagenasi attraverso il cordone, al fine di rimuovere eventuali residui che potrebbero essere rimasti nella nostra vena. Spingerò la collagenasi in quantità sufficiente.Quindi, quando uscirà dall'estremità qui da questa parte, lo vedremo di un colore pressoché identico a quello nella siringa. Dopodiché, provvederò a chiudere con una molletta l'estremità inferiore del cordone. Successivamente, spingerò un po' di collagenasi in più, giusto la quantità sufficiente per osservare il rigonfiamento del cordone.Dopo che si è espanso un po', procederò a massaggiare il cordone, partendo da sinistra verso destra. Di solito uso tre dita applicando una pressione moderatamente ferma. È quasi come arrotolare un impasto per la pasta.Non si vuole spingere il cordone troppo forte, ma nemmeno troppo delicatamente. Se si spinge troppo forte, si corre il rischio di una contaminazione da cellule muscolari lisce. Tuttavia, se lo si fa troppo delicatamente, non si riuscirà a staccare nessuna delle Q rimaste.Quindi circa cinque-sei secondi in un punto, spostandosi gradualmente verso il basso. Procederò quindi a trasferire il cordone dal tavolo nel bagnomaria a 37 gradi e lo lascerò in incubazione per 15 minuti. In alcuni casi potrebbe essere necessario incubare per 15 minuti.Un altro lotto potrebbe richiedere 20 minuti, e un terzo lotto potrebbe richiedere 10 minuti. È quindi importante ottimizzare il tempo di incubazione per il nostro lotto specifico. In questo caso, è di 15 minuti.Rimuoveremo i cavi dal bagno DPVS. Lo appoggeremo qui per un momento. Rimuoviamo il tappo dal nostro vial conico da 15 ml contenente i nostri 5 ml di feck al 20%.Il 20%feck contiene un inibitore della tripsina, quindi bloccherà l'azione del nostro collaghenasi. Ora procederò tenendo il cordone sopra il tubo con le nostre forbici. E quello che farò adesso è tagliare lungo la linea della nostra pinza.Spostate la sezione inferiore qui. Bene, ora abbiamo un taglio fresco all'estremità del nostro cordone. E quello che farò ora è spingere il collaghenasi attraverso il cordone.E ancora, proprio come con le hanks, non si vuole spingere troppo velocemente. Questa è all'incirca la velocità con cui si desidera spingere il mezzo attraverso. E questo è tutto per quanto riguarda il nostro collagenasi.A volte può capitare che la siringa sia fissata un po' troppo stretta. In queste situazioni, utilizzerò la pinza che avevamo usato per il cordone ombelicale e, fondamentalmente, la aggancerò proprio qui, svitando delicatamente e giusto il necessario per allentare il tutto, in modo da poterla rimuovere a mano o farla staccare da sola. Successivamente prenderò la nostra siringa da 20 ml rimanente contenente hangs e la attaccherò al nostro ago, quindi spingerò attraverso l'intero volume di hangs.Anche in questo caso, spingerò molto lentamente, proprio come con la collagenasi e l'altra siringa di Hank: ecco che arriva, goccia a goccia. Questa è all'incirca la velocità con cui si desidera far passare il mezzo. Questo contiene Hank al 20% e la nostra soluzione di collagenasi.Quello che farò ora è posizionarlo in una centrifuga e centrifugarlo per cinque minuti a 1200 giri al minuto. Quindi controllerò nuovamente per assicurarmi che il coperchio sia ben chiuso. I nostri due, e lo inserirò nella nostra centrifuga.Abbiamo centrifugato per cinque minuti a 1200 giri/min. Quindi abbiamo centrifugato il nostro vial conico da 50 ml per cinque minuti a 1200 giri/min. Quello che otteniamo è un piccolo pellet sul fondo del tubo. Questo pellet è costituito da alcuni globuli rossi residui e dalle nostre cellule endoteliali.Quello che farò ora consiste nell'aspirare il Bernet e il reus, sospendere il nostro pellet e aggiungere cinque millilitri di pipetta con 20% di fed, muovendola delicatamente su e giù alcune volte finché non si osserva quasi nessun materiale di scarto nella sospensione. Poi pipetterò l'intero volume di cinque millilitri e lo depositerò su una piastra T25. Cercherò di fare attenzione a non generare bolle d'aria.E ora aggiungerò il mio ECPS. Aggiungerò 50 microlitri e agiterò delicatamente il matraccio per assicurarmi che tutto l'ECPS si distribuisca nel contenitore. E questo è tutto.Procedi pure. Il matraccio è stato incubato a 37 gradi.

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Biologia

Il cordone ombelicale sono utilizzate per isolare le cellule muscolari lisce per vie diverse. In questo lavoro abbiamo usato il trattamento enzimatico per isolato cellule muscolari lisce.

Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)

Forniamo un metodo per isolare e popolazioni coltura pura di cellule endoteliali valvola cardiaca (VEC). VEC può essere isolato da entrambi i lati della cuspide o depliant e subito dopo, alla base di cellule interstiziali (VIC) isolamento è semplice.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Questo protocollo è preparato per condividere il nostro metodo di isolamento delle cellule endoteliali coronariche di topo a scopo di imaging o per condurre esperimenti di biologia molecolare.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Protocolli per la coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), la trasfezione transitoria di marcatori marcati in fluorescenza della crescita dei microtubuli, l'imaging di cellule vive e l'analisi automatizzata delle dinamiche di crescita dei microtubuli interfasici.

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

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Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Sebbene impegnativo, l'isolamento delle cellule endoteliali polmonari è essenziale per gli studi sull'infiammazione polmonare. Il presente protocollo descrive una procedura per l'isolamento ad alto rendimento e ad alta purezza delle cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari.

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