Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Per il cross-linking, seguito da immunoprecipitazione. Le cellule a una densità dell'80-90% vengono incubate con DSP ghiacciato da un millimolare in PBS, in assenza di calcio, magnesio o DMSO.

Controllo con veicolo. DSP è un crosslinker bifunzionale, permeabile alle membrane e riducibile, che stabilisce legami tra gruppi liberi posti a meno di 12 angstrom di distanza l'uno dall'altro. Dopo il cross-linking, le cellule vengono lisate ed eseguite immunoprecipitazioni utilizzando controlli standard.

I complessi proteici vengono quindi risolti mediante elettroforesi SDS-PAGE in condizioni riducenti, in cui gli agenti riducenti scindono il DSP, permettendo l'identificazione delle singole proteine mediante immunoblot. Ciao, sono Stephanie Ick del laboratorio del Dottor Victor Fonde del Dipartimento di Biologia Cellulare dell'Università di Emory. E io sono Pearl Ryder, anch'io del laboratorio Fonde.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento di complessi di myprotein mediante cross-linking controllato seguito da cromatografia di affinità immuno-magnetica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare interazioni proteiche transitorie e labili. Cominciamo dunque.

Iniziare etichettando la parte inferiore delle piastre cellulari per indicare il tipo cellulare e la specifica condizione sperimentale. Un simbolo positivo indica il trattamento con DSP, inclusi un controllo negativo con solo veicolo DMSO. Aggiungere il mezzo alle piastre per prepararle al seeding cellulare.

Cellule HEK seminate con un rapporto di diluizione di uno a cinque per consentire l'isolamento di 500 microgrammi di proteina per ogni reazione standard in provetta. Una singola provetta potrebbe essere sufficiente per identificare i possibili partner di legame di una proteina di interesse mediante immunoblot da analisi di spettrometria di massa. Aumentare il numero di reazioni standard almeno di dieci volte.

Preparare anche le soluzioni tampone per la maggior parte delle soluzioni utilizzate nell'esperimento di cross-linking. Queste includono PBS integrato con cloruro di calcio 0,1 millimolare e cloruro di magnesio 1 millimolare, denominato PBS calcio-magnesio. L'aggiunta di ioni calcio e magnesio è fondamentale per l'adesione delle cellule alla piastra di coltura.

Durante l'esperimento, conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Altri reagenti includono la soluzione di inibizione del crosslinker, il cocktail inibitore delle proteasi completo 50 X, che va vorticosato ogni 20 minuti fino a quando il pellet non si dissolve. Triton X-100 al 20%, che va conservato a quattro gradi Celsius e utilizzato entro un mese, e le soluzioni tampone A 10 X e 1 X.

Preparare e conservare tutte le soluzioni come specificato nel protocollo scritto allegato. Infine, preparare il buffer di lisi composto da buffer 1X con l'aggiunta di TRITTON X-100 allo 0,5% e il buffer per precipitazione immuno-magnetica o buffer IP, costituito da buffer 1X.

Aggiungere 0,1% TRITON X-101 fino a due giorni dopo la semina; a quel punto le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, condizione ottimale per il cross-linking. In condizioni di alta confluenza, le cellule tendono ad accumularsi le une sulle altre, riducendo l'accessibilità del crosslinker permeabile alle cellule. Riporre le piastre nell'incubatore fino al momento del cross-linking.

Preparare la soluzione del crosslinker DSP immediatamente prima di applicarla alle cellule. Il DSP è altamente idrofobico e pertanto viene sciolto nel DMSO fino a una concentrazione di 100 millimolari prima di essere diluito nel tampone PBS con calcio e magnesio. Per migliorare ulteriormente la diluizione del DSP nel tampone PBS con calcio e magnesio, riscaldare un volume appropriato e aggiungere 10 microlitri della soluzione madre di DSP in DMSO.

Per ogni millilitro di PBS caldo con calcio e magnesio, aggiungere la soluzione stock di D-S-P-D-M-S-O goccia a goccia con mescolamento ripetuto fino a quando tutto il DSP si sarà sciolto. Inoltre, preparare una soluzione di controllo veicolare costituita da 10 microlitri di DMSO per ogni millilitro di PBS con calcio e magnesio. Dopo la diluizione del DSP, mantenere tutte le soluzioni di PBS con calcio e magnesio in un bagno di ghiaccio e acqua per non più di 10 minuti.

Successivamente, preparare un bagno di acqua e ghiaccio in grado di contenere tutte le piastre utilizzate nell'esperimento. Prelevare quindi le piastre di coltura contenenti le cellule dall'incubatore a 37 gradi Celsius e posizionarle immediatamente nel bagno di acqua e ghiaccio. Lavare le cellule due volte con PBS freddo contenente calcio e magnesio, utilizzando gli stessi volumi preparati in precedenza per l'incubazione con il crosslinker; per una piastra a sei pozzetti, calcolare due millilitri per pozzetto e così via.

Dopo il secondo lavaggio, aggiungere al campione di controllo il veicolo, ovvero il DMSO disciolto nel buffer, oppure la soluzione di buffer cross-linking DSP, quindi incubare le cellule sul ghiaccio per due ore, controllando ogni circa 20 minuti per assicurarsi che tutte le cellule siano ricoperte dalla soluzione. Se alcune cellule dovessero risultare esposte, inclinare e ruotare la piastra in modo da ricoprirle nuovamente in modo uniforme; è normale che una piccola quantità di DSP precipiti.

Durante l'incubazione di due ore con le cellule, prima che termini il periodo di due ore, preparare una soluzione di spegnimento a 1x DSP diluendo lo stock in PBS con calcio e magnesio. Mantenere la soluzione sul ghiaccio fino al suo utilizzo per arrestare la reazione di cross-linking mediante l'inattivazione dello DSP non reagito. Trascorse le due ore, rimuovere dalle cellule la soluzione di controllo veicolare e quella di cross-linking.

Aggiungere la soluzione di arresto DSP ghiacciata e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Nel frattempo, diluire il cocktail completo di inibitori delle proteasi 1:50 nel buffer di lisi cellulare. Trascorsi i 15 minuti, lavare le cellule due volte con PBS contenente calcio e magnesio.

Quindi aggiungere il buffer di lisi contenente gli inibitori delle proteasi alle cellule e agitare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti di lisi cellulare, utilizzare una spatola per cellule per raccogliere le cellule dalla piastra. Assicurarsi di mantenere i lisati sul ghiaccio per minimizzare l'attività delle proteasi.

Centrifugare i lisati cellulari per 15 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco miniatura alla velocità massima di 15.000 G. Pipettare il sopranatante in una provetta nuova e scartare il pellet. Analizzare i livelli proteici utilizzando il saggio di Bradford e procedere con l'immunoprecipitazione. Iniziare a prepararsi per l'immunoprecipitazione immediatamente dopo aver avviato la reazione di cross-linking della durata di due ore in provette microcentrifuga con tappo a vite.

Combinare 30 microlitri di microsferette immunomagnetiche anti-IgG con 500 microlitri di buffer IP. Aggiungere l'anticorpo contro l'antigene di interesse. La quantità appropriata di anticorpo deve essere determinata per ciascun antigene specifico.

In esperimenti preliminari, possibili controlli negativi per le perle includono l'assenza di anticorpo, perle senza anticorpo e perle con anticorpo di controllo isotipico per legare l'anticorpo IP alle perle magnetiche. Incubare su un agitatore rotante end-over-end per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, effettuare una breve centrifugazione dei tubi e inserirli nel supporto magnetico. Le perle si concentreranno sul lato del magnete.

Rimuovere la soluzione contenente gli anticorpi non legati e lavare immediatamente le perle per evitare che si secchino. Dopo due lavaggi, aggiungere 500 microlitri di un microgrammo per millilitro di lisato cellulare negativo per DSP o positivo per DSP nei tubi appropriati. Un controllo negativo con competizione peptidica può essere preparato a questo stadio aggiungendo il peptide immunogeno a una concentrazione determinata in esperimenti preliminari alla miscela di perle e lisato.

Un altro possibile controllo negativo che può essere preparato in questa fase è una reazione senza lisato, contenente solo il buffer, preparata aggiungendo 500 microlitri di buffer di lisi solo alle perle. Ripesare delicatamente le perle per le reazioni sperimentali e di controllo. Non vortexare poiché ciò potrebbe causare la rottura delle perle; incubare a quattro gradi con rotazione end-over-end per due ore.

Trascorse due ore, rimuovere il lisato utilizzando il supporto magnetico. Eseguire una breve centrifugazione e lavare le perle per un totale di sei volte con un millilitro di buffer IP, incubando ogni lavaggio a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Per eludere i complessi legati, aggiungere un volume di buffer per gel al campione nel tubo di immunoprecipitazione appena sopra il pellet di perline. Per raccogliere le perline sul fondo del tubo, battere delicatamente la base del tubo in modo da riportare tutte le perline in sospensione nel buffer per gel. In alternativa, per l'isolamento mediante affinità immuno, aggiungere 30 microlitri di buffer supplementato con il peptide immunogeno alle perline.

La concentrazione richiesta del peptide immunogeno viene determinata empiricamente. Dopo aver testato un intervallo compreso tra 10 e 200 micromolar, incubare le perle a quattro gradi per due ore, agitando i tubi ogni 30 minuti. Utilizzare il supporto magnetico per rimuovere i 30 microlitri contenenti i complessi eluiti e conservarli in un tubo pulito; lavare le perle con buffer IP e conservarle.

Aggiungere un volume di tampone campione gel alle perle per entrambi i metodi di eluizione. Riscaldare le perle immunomagnetiche ri-sospese nel tampone campione gel a 75 gradi Celsius per cinque minuti, oltre alla denaturazione delle proteine. Questo passaggio scinderà anche la molecola DSP, consentendo la risoluzione delle singole proteine nel complesso analizzato.

I campioni su un gel SDS-PAGE per il western blotting. Le microsfere magnetiche immunologiche svuotate possono essere allontanate mediante centrifugazione e rimosse dal campione con un supporto magnetico prima del caricamento. Se l'EUA di affinità immunologica è priva di IgG sia mediante colorazione proteica dell'SDS-PAGE che mediante immunoblot, è adatta per la spettrometria di massa.

Di seguito è riportato un esempio di western blot di materiale ottenuto da lisati cellulari cross-linkati e non cross-linkati, seguito da precipitazione immuno-magnetica mediante un anticorpo monoclonale contro la subunità delta del complesso AP. Il cross-linking consente la rilevazione di proteine interagenti non visibili nei campioni non cross-linkati durante le isolazioni immuno-magnetiche. I controlli negativi non mostrano un arricchimento specifico di proteine utilizzando un anticorpo assente o un controllo di isotipo abbinato, impiegando un IgG diretto contro il recettore della transferrina sia per i campioni non cross-linkati che per quelli cross-linkati.

In questo esempio, è stata utilizzata l'eluzione con peptidi ad affinità per recuperare le proteine legate all'anticorpo IP. Si noti che l'anticorpo immuno è assente nella frazione del sopranatante e rimane nella frazione del pellet durante l'eluzione con peptidi. È stato appena illustrato come isolare complessi MultiPro labili utilizzando il crosslinker chimico DSP, seguito da purificazione ad affinità immuno-magnetica.

Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere le soluzioni cellulari e i lisati freddi per preservare le interazioni labili durante l'incrocio e per minimizzare l'attività delle proteasi. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.