Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Per la reticolazione, seguita da immunoprecipitazione. Le cellule procedurali con una densità compresa tra l'80 e il 90% vengono incubate con un millimolare ghiacciato. DSP solo in PBS, calcio, magnesio o DMSO.

Controllo del veicolo. DSP è un reticolante omo bifunzionale permeabile alla membrana e riducibile che si lega senza reticoli e significa entro 12 angstrom l'uno dall'altro. Successivamente, le cellule reticolanti vengono lisate e le immunoprecipitazioni vengono eseguite utilizzando controlli standard.

I complessi proteici vengono quindi risolti riducendo la pagina SDS, riducendo il DSP degli agenti, consentendo l'identificazione di singole proteine mediante immuno blot. Ciao, sono Stephanie Ick del laboratorio del Dr.Victor Fonde nel Dipartimento di Biologia Cellulare della Emory University. E io sono Pearl Ryder, anche lei del laboratorio Fonde.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'isolamento di complessi di miproteine utilizzando la reticolazione controllata seguita dalla cromatografia di affinità immunomagnetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le interazioni proteiche labili transitorie. Quindi iniziamo.

Inizia etichettando la parte inferiore delle piastre cellulari per indicare il tipo di cellula e la condizione sperimentale specifica. Un simbolo positivo indica che il DSP trattato include un controllo negativo del veicolo solo DMSO. Aggiungere il terreno alle piastre per prepararle per la piastra di semina cellulare.

Cellule HEK seminate a una diluizione da uno a cinque per consentire l'isolamento di 500 microgrammi di proteine per reazione in provetta standard. Una singola provetta può essere sufficiente per identificare i partner di legame putativi di una proteina di interesse mediante immuno blot dall'analisi di spettrometria di massa. Aumenta il numero di reazioni standard almeno 10 volte.

Preparare anche i gambi della maggior parte delle soluzioni utilizzate nell'esperimento di reticolazione. Questi includono PBS integrato con 0,1 millimolari di cloruro di calcio e un millimolare di cloruro di magnesio chiamato PBS calcio magnesio. L'aggiunta di ioni calcio e magnesio è fondamentale per l'adesione delle cellule alla piastra di coltura.

Durante il corso dell'esperimento, conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Altre scorte includono la soluzione di quenching reticolante 50 X cocktail completo di inibitori della proteasi, che viene agitato a vortice ogni 20 minuti fino a quando il pellet non si è sciolto. 20% Tritan X 100, che viene conservato a quattro gradi Celsius e deve essere utilizzato entro un mese e 10 x e uno x Buffer a soluzioni.

Preparare e conservare tutte le soluzioni come descritto nel protocollo scritto allegato. Infine, preparare il tampone di lisi composto da un tampone X. A più 0,5% TRITTON X 100 e tampone di precipitazione immunomagnetica o tampone IP costituito da un tampone X.

A più 0,1% TRITTON X 101 a due giorni dopo la placcatura, le celle hanno una fluenza dell'80-90%, che è ottimale per la reticolazione. In condizioni di alta cofluenza, le cellule tendono ad accumularsi l'una sull'altra, portando a una diminuzione dell'accessibilità del reticolante permeabile cellulare a tutte le cellule. Riposizionare le piastre nell'incubatrice fino al momento della reticolazione.

Preparare la soluzione di reticolante DSP immediatamente prima di applicarla sulle cellule. Il DSP è altamente idrofobo e viene quindi disciolto in DMSO a una concentrazione di 100 millimolari prima di diluirsi nel tampone calcio e magnesio PBS. Per migliorare ulteriormente la diluizione del DSP nel tampone di calcio e magnesio PBS, in un volume caldo e adeguato, aggiungere 10 microlitri della soluzione madre di DSP e DMSO.

Per ogni millilitro di magnesio calcico PBS caldo, aggiungere la soluzione madre D-S-P-D-M-S-O goccia a goccia mescolando ripetutamente fino a quando tutto il DSP non si è sciolto. Inoltre, preparare una soluzione di controllo del veicolo di 10 microlitri di DMSO per ogni millilitro di PBS calcio magnesio. Dopo aver diluito il DSP, conservare tutte le soluzioni di calcio e magnesio PBS in un bagno di acqua ghiacciata per non più di 10 minuti.

Successivamente, prepara un bagno di acqua ghiacciata che conterrà tutte le piastre utilizzate nell'esperimento. Procedere con il prelievo delle piastre di coltura contenenti le cellule dall'incubatore a 37 gradi Celsius e posizionarle immediatamente nel bagno di acqua ghiacciata. Lavare due volte le cellule con PBS calcio magnesio ghiacciato, utilizzando gli stessi volumi preparati in precedenza per l'incubazione con il reticolante per sei, calcolare due millilitri per pozzetto e così via.

Dopo il secondo lavaggio. Aggiungere il controllo del veicolo, che è il DMSO disciolto nel tampone, o la soluzione tampone di reticolazione DSP, alle cellule incubare su ghiaccio per due ore e controllare circa ogni 20 minuti per assicurarsi che tutte le cellule siano coperte dalla soluzione. Se alcune cellule vengono esposte, inclinare e ruotare il piatto per coprirle di nuovo in modo uniforme, è normale che precipiti una piccola quantità di DSP.

Durante le due ore di incubazione con le cellule prima della fine dell'incubazione di due ore, preparare una soluzione di quenching a un XDSP diluendo il gambo in PBS calcio magnesio. Mantenere la soluzione in ghiaccio fino a quando non viene utilizzata per fermare la reazione di reticolazione inattivando il DSP che non ha reagito. Allo scadere delle due ore, rimuovere le soluzioni di controllo del veicolo e di reticolazione dalle celle.

Aggiungere la soluzione dissetante DSP ghiacciata e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Nel frattempo, diluire il brodo completo di inibitori della proteasi da uno a 50 nel tampone di lisi cellulare. Una volta trascorsi i 15 minuti, lavare le cellule due volte con PBS calcio magnesio.

Quindi aggiungere il tampone di lisi contenente gli inibitori della proteasi alle cellule e agitare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti di lisi cellulare, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule dalla piastra. Assicurati di mantenere i lisati sul ghiaccio per ridurre al minimo l'attività della proteasi.

Far girare i lisati cellulari per 15 minuti a quattro gradi Celsius in una mini centrifuga da banco alla velocità massima di 15.000 Gs.Pipettare il surnatante in una provetta nuova e scartare il pellet. Analizzare i livelli proteici utilizzando il saggio di Bradford e procedere con l'immunoprecipitazione. Iniziare a prepararsi per l'immunoprecipitazione subito dopo aver iniziato la reazione di reticolazione di due ore in provette per microcentrifuga con tappo a vite.

Combina 30 microlitri di microsfere immunomagnetiche anti IgG con 500 microlitri di tampone IP. Aggiungere l'anticorpo contro il bersaglio di interesse. La quantità appropriata di anticorpi deve essere determinata per ogni singolo antigene.

Negli esperimenti preliminari, i possibili controlli negativi per le perle non includono l'assenza di anticorpi, le perle e le perle di anticorpi di controllo isotipo per legare l'anticorpo IP alle perle magnetiche. Incubare in un bilanciere terminale per due ore a temperatura ambiente Al termine dell'incubazione, far girare rapidamente le provette e farle scorrere nel supporto magnetico. Le perline si concentreranno sul lato del magnete.

Rimuovere la soluzione contenente anticorpi non legati e lavare immediatamente le perle per evitare che si secchino. Dopo due lavaggi, aggiungere 500 microlitri di un microgrammo per millilitro di lisato cellulare DSP negativo o DSP positivo nelle provette appropriate. In questa fase è possibile preparare un controllo negativo per la competizione peptidica aggiungendo il peptide immunogenico a una concentrazione determinata in esperimenti preliminari alla miscela di perle di lisato.

Un altro possibile controllo negativo preparato in questa fase è una reazione tampone o priva di lisato preparata aggiungendo 500 microlitri di tampone di lisi solo alle perle. Risospendere delicatamente le perle per le reazioni sperimentali e di controllo. Non vorticare in quanto ciò causerà la rottura delle perle, l'incubazione a quattro gradi con rotazione da un'estremità all'altra per due ore.

Al termine delle due ore, rimuovere il lisato utilizzando il supporto magnetico. Centrifuga e lava rapidamente le perle per un totale di sei volte con un millilitro di tampone IP. Incubando ogni lavaggio a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Per eludere i complessi legati, aggiungere un tampone per campioni di gel al tubo IP appena sopra il pellet di perline. Per raggruppare le perle sul fondo della provetta, picchiettare delicatamente il fondo della provetta per far sì che tutte le perle vengano risospese nel tampone del campione di gel. In alternativa, per l'isolamento di immunoaffinità a 30 microlitri di tampone è integrato con il peptide immunogenico alle sfere.

La concentrazione richiesta del peptide immunogenico è determinata empiricamente. Dopo aver testato un intervallo da 10 a 200 micromolari, incubare le perle a quattro gradi per due ore, picchiettare le provette ogni 30 minuti. Utilizzare il supporto magnetico per rimuovere i 30 microlitri contenenti i complessi elusi e conservare in un tubo pulito lavaggio con tampone IP e conservare le perline.

Aggiungere un tampone per campioni di gel alle perle per entrambi i metodi di eluizione. Riscaldare le microsfere immunomagnetiche sospese in un tampone per campioni di gel a 75 gradi Celsius per cinque minuti, oltre a denaturare le proteine. Questo passaggio taglierà anche la molecola DSP consentendo di risolvere le singole proteine nel complesso run.

I campioni su un gel per pagina SDS per western blotting. Le microsfere immunomagnetiche svuotate possono essere respinte mediante centrifugazione e rimosse dal campione con un supporto magnetico prima del caricamento. Se l'immunoaffinità EUA è priva di IgG sia per colorazione proteica della pagina SDS che per immuno blots, è adatta per la spettrometria di massa.

Ecco un esempio di western blot di materiale da lisato cellulare reticolato e non reticolato, seguito da precipitazione immunomagnetica utilizzando un anticorpo monoclonale contro la subunità AP tre. Il reticolazione delta consente il rilevamento di proteine interagenti non osservate in campioni non reticolati durante gli isolamenti immunomagnetici. I controlli negativi hanno mostrato che non c'è alcun pull down proteico specifico utilizzando il controllo anticorpale libero e l'isotipo anticorpale abbinato utilizzando una IgG diretta contro il recettore della transferrina sia per i campioni non reticolati che per quelli reticolati.

In questo esempio, l'eluizione del peptide di affinità è stata utilizzata per recuperare le proteine legate all'anticorpo IP. Si noti che l'immuno anticorpo è assente nella frazione supernat e rimane nella frazione di battito durante l'eluizione del peptide. Abbiamo appena mostrato come isolare i complessi MultiPro labili utilizzando il reticolante chimico DSP, seguito dalla purificazione dell'affinità immunomagnetica.

Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere le soluzioni cellulari e i lisati freddi per mantenere le interazioni labili durante la reticolazione e per ridurre al minimo l'attività della proteasi. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.