Name: Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come isolare complessi proteici labili in vivo mediante reticolazione incrociata controllata con DSP e cromatografia di affinità immuno-magnetica. Questa tecnica stabilizza interazioni proteiche transienti per studi di biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health a VF (NS42599 e GM077569).

1. Preparazione per reticolazione <ol><li> Avrete bisogno di piatto un numero sufficiente di celle per consentire l'isolamento di 500 mg di proteine ​​per reazione tubo standard. Un tubo singolo può essere sufficiente per l'identificazione di putativi interattori di una proteina di interesse da immunoblot. In questo caso tallone materiale legato può essere eluito con SDS-PAGE tampone del campione (immunoprecipitazione). Per l'analisi di spettrometria di massa, il numero di reazioni standard dovrebbe essere aumentata almeno dieci volte e complessi di proteine ​​deve essere eluita da fuori concorso con un antigene peptide riconosciuto dal anticorpo utilizzato (immunoaffinità cromatografia). Questa strategia permetterà l'isolamento di complessi proteici liberi di immunoglobuline. </li><li> La densità cellulare ottimale per reticolazione è compresa tra 75% e il 90% confluenza. In condizioni di elevata confluenza, le cellule tendono ad accumularsi uno sull'altro, che diminuisce l'accessibilità alla cella-permeabile reticolante a tutte le celle. </li><li> Tipo di cellula e dalle condizioni sperimentali devono essere etichettati sul fondo della piastra cellulare. Ci sono controlli di routine con solo veicolo. </li><li> Preparare tutte le soluzioni TRANNE la soluzione DSP prima di reticolazione. <ol><li> Preparare uno stock di tampone fosfato tampone salino con CaCl 2 0,1 mM e CaCl 2 1 mM (PBS / Ca / Mg) prima di iniziare l'esperimento. L'aggiunta di ioni calcio e magnesio è fondamentale per l'adesione delle cellule alla piastra di coltura nel corso dell'esperimento. Conservare a 4 ° C. </li><li> 50X completa inibitori della proteasi Cocktail - 1 compressa sciolta in 1 ml di acqua Milli-Q. Conservare a -20 ° C. </li><li> 20% di Triton X-100 Pesare 10g Triton X -100 e diluire a volume totale di 50 ml di acqua Milli-Q. Roccia a 4 ° C per una notte e conservare a 4 ° C fino all'uso. Non conservare per più di 1 mese. Utilizzare diluizioni di questo stock del 20% per preparare il buffer di lisi e IP descritto di seguito. </li><li> 50X DSP tempra Soluzione TRIS 1M a pH 7.4. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un tampone 10x Una soluzione. Buffer 10X A: <ul><li> 50 ml 1 M HEPES </li><li> 150 ml di NaCl 5 M </li><li> 10 mL 0,5 M EGTA </li><li> 250 microlitri 2 M MgCl 2 </li><li> Regolare il pH a 7,4 </li><li> Portare il volume finale a 500 ml </li></ul> Il tampone 10X Una soluzione viene diluita a 1X tampone A seconda delle necessità. Buffer 1x A è utilizzato anche in lisato e immuno-magnetico-precipitazione buffer. Un tampone 1X <ul><li> 10 mM Hepes </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 0.1 mM MgCl 2 </li><li> pH 7,4 </li></ul></li><li> Tampone di Lysis Buffer 1X A + 0,5% Triton X-100. </li><li> Immuno-magnetica Buffer Precipitazioni (IP Buffer) 1X tampone A + 0,1% Triton X-100. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione della soluzione di reticolazione <ol><li> Preparare la soluzione DSP immediatamente prima di applicare alle cellule. DSP è altamente idrofoba e deve essere sciolto in DMSO prima di diluire in PBS / Ca / Mg buffer. Sciogliere 40 mg di DSP in 1 ml di DMSO. Questo rende una soluzione 100 mM di DSP (Il peso molecolare di DSP è 404,42 g / mol). </li><li> Caldo un volume adeguato di PBS / Ca / Mg a 37 ° C al fine di facilitare la diluizione del DSP / DMSO in PBS. Volumi necessari per dimensioni piatto assortito: 6-pozzetti 2 mL per pozzetto 10 centimetri tavola 10 mL per piastra 15 centimetri piatto 20 ml per piastra </li><li> Aggiungere 10μL di DSP / DMSO soluzione madre per ogni 1 ml di PBS caldo / Ca / Mg. Aggiungi DSP / DMSO goccia a goccia soluzione madre con miscelazione ripetuto fino a quando tutti i DSP si è dissolto. Ottenere una soluzione di controllo di 10 microlitri di DMSO aggiunto ad ogni 1 ml di PBS / Ca / Mg. </li><li> Mettere tutti PBS / Ca / Mg soluzioni in un bagno di acqua e ghiaccio non più di 10 min. </li></ol> 3. Preparare Celle per reticolazione <ol><li> Preparare un bagno di ghiaccio d'acqua che si adatta tutte le lastre di reticolazione o controllo di incubazione del veicolo. </li><li> Prendere le piastre dal 37 ° C incubatore e metterli immediatamente in ghiaccio acqua sporca. </li><li> Lavare le cellule due volte con gelida PBS / Ca / Mg. Utilizzare lo stesso volume che verrà utilizzato per l'incubazione reticolante (vedi sezione 2.2). </li><li> Rimuovere il secondo lavaggio e aggiungere il controllo di veicoli o di una soluzione tampone reticolazione DSP. </li><li> Incubare in ghiaccio per due ore. Si dovrebbe controllare le piastre circa ogni venti minuti per assicurare che tutte le cellule sono coperti da una soluzione. Si può notare una piccola quantità di DSP precipitare dalla soluzione. Questo è normale. </li></ol> 4. Inattivazione di reazione DSP <ol><li> Preparare una soluzione 1X tempra DSP di 20 mM Tris pH 7.4 in PBS / Ca / Mg (20 ml di 1 M Tris pH 7,4 per ogni 1 ml di PBS / Ca / Mg). </li><li> Rimuovere il controllo del veicolo e le soluzioni reticolazione. </li><li> Aggiungi ghiacciata soluzione inattivazione e incubare in ghiaccio per 15 minuti. </li></ol> 5. Cellula Lysis <ol><li> Durante l'incubazione tempra DSP, preparare il tampone di lisi delle cellule del 0,5% Triton X-100 in tampone A con cocktail Completa inibitore della proteasi. Aggiungere 20 ul di soluzione di 50X magazzino completo per ogni buffer 1 lisi ml. </li><li> Seguendo i 15 minuti di incubazione tempra DSP, lavare le cellule due volte con PBS / Ca / Mg. </li><li> Aggiungi tampone di lisi + completa alle cellule e rock a 4 ° C per 30 minuti. Alcuni hanno suggerito volumi di tampone di lisi per dimensioni piatto assortito: <ul><li> 6-pozzetti 0,5 mL per pozzetto </li><li> 10 centimetri piastra 1 ml per piastra </li><li> 15 centimetri piastra 1 ml per piastra </li></ul></li><li> Dopo la lisi, usare un raschietto cellula per raccogliere le cellule dalla piastra. Essere sicuri di mantenere lisati sul ghiaccio per ridurre al minimo l'attività della proteasi </li><li> Spin lisati cellulari per 15 minuti a 4 ° C in un banco mini-centrifuga alla massima velocità (15.000 xg). </li><li> Pipettare il supernatante in una nuova provetta. Eliminare il pellet. </li><li> Analizzare i livelli di proteine ​​e procedere con immunoprecipitazione. </li></ol> 6. Preparazione Immuno-magnetico Perline Precipitazioni Nota: questo passaggio è di solito avviato direttamente dopo l'inizio l'incubazione reticolazione 2 ore. <ol><li> Unire 30 ml di Dynal sfere immunomagnetiche, 500 ml di IP Buffer (1x tampone A + 0,1% Triton X-100) e la giusta quantità di antigene-anticorpo specifico per screwtop tubi microcentrifuga. Preparare anticorpi liberi e non specifici anticorpi tubi per i controlli negativi. La giusta quantità di anticorpi deve essere determinato sulla base di singoli antigeni durante gli esperimenti separati. Etichetta tutti i tubi IP. </li><li> Lasciare i tubi IP ad incubare in una soluzione end-over-end rocker a temperatura ambiente per due ore. In alternativa, incubare i tubi IP con anticorpi overnight a 4 ° il giorno prima della reticolazione. </li><li> Dopo l'incubazione, fare un rapido 10 secondi mini-centrifugazione per raccogliere le perle sul fondo della provetta. </li><li> Far scorrere i tubi nel supporto magnetico, che farà rientrare il sfere magnetiche lontano dal fondo della provetta. Con le perle in modo sicuro fuori del modo, si può ora facilmente lavare via ogni anticorpo non legato. </li><li> Utilizzare una piccola mancia aspiratore portava come una punta di caricamento del gel, o P200 punta a rimuovere il tampone di incubazione e qualsiasi anticorpo non legato. Non appena il volume di incubazione è stato rimosso aggiungere in 1 ml di IP Buffer. </li><li> Chiudere la provetta, delicatamente risospendere le perline, e tutti i tubi IP incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con end-over-end di rotazione. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio 5 minuti (6,3 punti con 6,6) ancora una volta con un millilitro fresco di IP Buffer. </li><li> I tubi IP può rimanere in incubazione ultimo lavaggio fino a quando il lisato reticolato è pronto per essere aggiunto ai talloni. </li></ol> 7. Incubare lisato reticolato con Immuno-magnetico Perline <ol><li> Dopo l'ultimo lavaggio di spin immuno-magnetico perline, giù in una mini-centrifuga per 10 secondi. Quindi procedere a scivolare i tubi nel supporto magnetico. </li><li> Ancora una volta, con una piccola mancia aspirazione foro, rimuovere il volume di incubazione dal tubo. Immediatamente aggiungere 500 microlitri di lisato cellulare reticolato (assumendo lisato a 1 mg / ml) per i tubi contenenti immuno-magnetico perline. Se si prevede di utilizzare concorrenza peptide come controllo negativo, una quantità appropriata di peptide dovrebbe essere incluso, a questo punto. Precedenti esperimenti devono essere effettuati per determinare adeguate condizioni di concorrenza peptide. In alternativa, si consiglia di avere lisato libero immuno-magnetico perle come controllo negativo. In questo caso, immediatamente aggiungere 500 ml di lisato Buffer (1x tampone A + 0,5% Triton X-100) + completa per immuno-magnetico perline. </li><li> Risospendere delicatamente le sfere. Microsfere in sospensione devono essere incubate a 4 ° in un fine-over-end di rotazione per 2 ore. </li></ol> 8. Lavare LISATO Unbound di Perline <ol><li> Una volta lisato ha avuto il tempo sufficiente incubazione, fare un rapido giro 10 secondi in un mini-centrifuga. Quindi, far scorrere i tubi nel supporto magnetico. Il supporto magnetico deve essere conservato in un bagno di ghiaccio per il resto l'esperimento. </li><li> Utilizzando una piccola mancia aspiratore foro, rimuovere tutti i lisato non legato. Immediatamente dopo che tutti lisato non legato viene rimosso aggiungere 1 ml di IP Buffer. </li><li> Chiudere la provetta e delicatamente risospendere le sfere. </li><li> Una volta che le perle sono risospeso ripetere il passaggio tallone pellettizzazione (8,1). </li><li> Ancora una volta aspirato fuori tutto il volume di incubazione e subito aggiungere 1 ml di IP Buffer, poi tappo il tubo. </li><li> Risospendere delicatamente le perle in IP Buffer. Incubare microsfere in sospensione per 5 minuti a 4 ° con end-over-end a dondolo. </li><li> Ripetere le operazioni di lavaggio tallone (8,4 per 8,6) 4 volte di più. </li></ol> 9. Denaturare campione e raccogliere da perline <ol><li> Dopo che tutte le immuno-magnetico tubi precipitazione sono stati lavati, ri-sedimento le perline (8,1) e tubi di scivolare nellasupporto magnetico. </li><li> Le proteine ​​legate alla immuno-magnetico perline vengono rimossi in condizioni di denaturazione. Aspirare fuori l'ultimo lavare IP Buffer e rimuovere il tubo IP dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungi 1x Sample Buffer Gel al tubo IP appena sopra il pellet tallone mettere in comune le perline sul fondo del tubo di nuovo. La quantità di tampone campione dipende dalle dimensioni e del gel da utilizzare. Potrebbe essere necessario premere delicatamente il fondo della provetta per ottenere tutte le microsfere in sospensione nel Sample Buffer Gel. </li><li> Ripetere il processo di denaturazione (9,2 per 9,3) per ogni tubo IP. </li><li> Immuno-magnetico perline risospese nel tampone Gel campioni vengono poi riscaldate a 75 ° C per 5 minuti per completare il processo di denaturazione. </li><li> Una volta che il campione è stato denaturato può essere eseguito su un gel SDS-PAGE per blotting occidentale. Svuotato Immuno-Magnetic Beads può essere ri-pellet per centrifugazione e rimosso dal campione con il supporto magnetico. </li></ol> 10. Eluizione dei complessi reticolato con peptidi antigenici (immunoaffinità Chromatography). <ol><li> Dopo che tutte le immuno-magnetico tubi immunoprecipitazione sono stati lavati, ri-sedimento le perline (8,1) e tubi diapositiva nel supporto magnetico. Aspirare il surnatante e aggiungere 10 ml di tampone A integrato con il peptide antigenico riconosciuto dagli anticorpi utilizzati per immunoisolamento di complessi proteici. È necessario verificare concentrazioni comprese 1-20 mM per l'eluizione efficiente. </li><li> Incubare le perline per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Mettere perle nello stand magnetico e con attenzione recuperare i 10 ml di materiale eluito. Salva questo supernatante. </li><li> Lavare rapidamente le perline con tampone A e scartare il lavaggio. Salva le perline. </li><li> Aggiungi Sample buffer Gel per il supernatante salvato e perline per una concentrazione di 1X. Incubare le provette a 75 ° C per 5 minuti. </li><li> Analizzare perline e eluato peptide mediante SDS-PAGE. L'eluato dovrebbe essere libero di IgG sia da proteine ​​macchia di SDS-PAGE o immunoblot (Figura 1B). Questo materiale libero di IgG è adatto per spettrometria di massa. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Isolamento di AP-3 complessi di proteine ​​che interagiscono e proteine ​​di membrana. Cellule HEK293 (A) o cellule PC12 (B) sono stati trattati sia in presenza di controllo del veicolo (DMSO, dispari corsie Fig. 1A) o DSP (anche corsie fig. 1A o tutti corsie in Fig. 1B). Estratti chiarito sono state incubate sia con perline da solo (Fig. 1A, Lanes 3-4), anticorpi contro il recettore della transferrina (Fig. 1A, Lanes 5-6), o AP-3 anticorpi δ (Fig. 1A, Lanes 7-10; Fig. . 1B, corsie 1-10). Immunocomplessi sono stati eluiti con SDS-PAGE tampone del campione (Fig. 1A), tampone A soli o (Fig. 1B, corsie 1-2), o tampone A integrato con concentrazioni crescenti del peptide antigenico δ corrispondente al aminoacidi 680 710 delle risorse umane δ-adaptin (NCBI: AAD03777; gi: 1923266) (Fig. 1B, corsie 3-10). Questo peptide si lega l'anticorpo δ. Dopo l'eluizione peptide, surnatanti (S) e perline (B) sono stati analizzati mediante immunoblot (Fig. 1B). AP-3, che viene rilevata con anticorpi contro il δ, β3 e σ3 subunità, coprecipitates con i seguenti fattori solubili: clatrina catena pesante (CHC), il BLOC-1 pallidin subunità, e il luppolo vps33b subunità complesso, così come le proteine ​​di membrana fosfatidil-4-chinasi di tipo II alfa (PI4KIIα) e il trasportatore di zinco 3 (ZnT3). Si noti l'assenza di IgG catene del mouse pesanti nel peptidi eluiti surnatante in fig. 1B.

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSP, una membrana permeabile, reticolante chimicamente riducibili con un braccio distanziatore di 12 A viene utilizzato per stabilizzare le interazioni proteina transitoria 1,2,3,4. Qui abbiamo esemplificato questa strategia con il complesso adattatore AP-3 un complesso proteina solubile che riconosce e ordina proteine ​​di membrana in vescicole da endosomi 5. AP-3 si lega selettivamente al trasportatore di zinco ZnT3 e la chinasi dei lipidi fosfatidilinositolo-4-chinasi di tipo II, ma non dei rece...

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>Sciogliere 1 compressa in 200 mL di acqua; aggiungere MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fino a una concentrazione finale di 1 mM e CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fino a una concentrazione finale di 0,1 mM</td></tr><tr><td>Ditiobis(succinimidil propionato) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>Sensibile all'umidità, conservare in un contenitore ermetico a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, anticorpo anti-topo IgG di pecora</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>Le perline sono disponibili anche come anticorpo anti-coniglio di pecora</td></tr><tr><td>Magnete Dyna-Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di labile multi-proteina complessi da in vivo controllato cellular cross-linking e immuno-magnetica cromatografia di affinità

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

La natura dinamica di macchine cellulare è spesso costruito sulle associazioni di proteine ​​transitori e / o debole. Queste interazioni bassa affinità preclude metodi rigorosi per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di reti di proteine ​​intorno ad una proteina di interesse. L&#39;uso di reticolanti chimici permette la stabilizzazione selettiva delle interazioni labili, aggirando così le limitazioni biochimiche per la purificazione. Qui vi presentiamo un protocollo suscettibile di cellule in coltura che utilizza un reticolante homobifunctional con un braccio distanziatore di 12 Å, dithiobis-(succinimidile propionato) (DSP). DSP è scissa dalla riduzione di un legame disolfuro presenti nella molecola. Cross-linking in combinazione con la cromatografia di immunoaffinità di proteine ​​di interesse con perline magnetiche permette l&#39;isolamento di complessi proteici che altrimenti non avrebbe resistere purificazione. Questo protocollo è compatibile con le normali tecniche di Western Blot e può essere scalata per l&#39;identificazione delle proteine ​​mediante spettrometria di massa 1. Stephanie A. Zlatic e Pearl V. Ryder contribuito in maniera uguale a questo lavoro.

La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e labile<em&gt; In vivo</em&gt;, Che consente loro isolamento utilizzando rigorosi tecniche di purificazione di proteine ​​complesse. Qui vi presentiamo una tecnica per la reticolazione cellule in coltura seguita da isolamento di complessi proteici da immunoprecipitazione.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

La natura dinamica dei macchinari cellulari si basa frequentemente su associazioni proteiche transitorie e/o deboli. Queste interazioni a bassa affinità precludono...

Per il cross-linking, seguito da immunoprecipitazione. Le cellule a una densità dell'80-90% vengono incubate con DSP ghiacciato da un millimolare in PBS, in assenza di calcio, magnesio o DMSO.Controllo con veicolo. DSP è un crosslinker bifunzionale, permeabile alle membrane e riducibile, che stabilisce legami tra gruppi liberi posti entro 12 angstrom l'uno dall'altro. Dopo il cross-linking, le cellule vengono lisate ed eseguite immunoprecipitazioni utilizzando controlli standard.I complessi proteici vengono quindi risolti mediante elettroforesi SDS-PAGE in condizioni riducenti, in cui gli agenti riducenti scindono il DSP, permettendo l'identificazione delle singole proteine mediante immunoblot. Ciao, sono Stephanie Ick del laboratorio del Dottor Victor Fonde del Dipartimento di Biologia Cellulare dell'Università di Emory. E io sono Pearl Ryder, anch'io del laboratorio Fonde.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento di complessi di myprotein mediante cross-linking controllato seguito da cromatografia di affinità immuno-magnetica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare interazioni proteiche transitorie e labili. Cominciamo dunque.Iniziare etichettando la parte inferiore delle piastre cellulari per indicare il tipo cellulare e la specifica condizione sperimentale. Un simbolo positivo indica il trattamento con DSP, inclusa una condizione di controllo con solo veicolo negativo DMSO. Aggiungere il mezzo alle piastre per prepararle al seeding cellulare.Cellule HEK seminate con un rapporto di diluizione di uno a cinque per consentire l'isolamento di 500 microgrammi di proteina per ogni reazione standard in provetta. Una singola provetta può essere sufficiente per identificare i potenziali partner di legame di una proteina d'interesse mediante immunoblot dall'analisi di spettrometria di massa. Aumentare il numero di reazioni standard di almeno dieci volte.Preparare anche le soluzioni tampone per la maggior parte delle soluzioni utilizzate nell'esperimento di cross-linking. Queste includono PBS integrato con cloruro di calcio 0,1 millimolare e cloruro di magnesio 1 millimolare, denominato PBS calcio-magnesio. L'aggiunta di ioni calcio e magnesio è fondamentale per l'adesione delle cellule alla piastra di coltura.Durante l'esperimento, conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Altri reagenti includono la soluzione di inibizione del crosslinker, il cocktail inibitore delle proteasi completo 50 X, che va vorticosato ogni 20 minuti fino a quando il pellet non si dissolve. Triton X-100 al 20%, che va conservato a quattro gradi Celsius e utilizzato entro un mese, e le soluzioni tampone A 10 X e 1 X.Preparare e conservare tutte le soluzioni come specificato nel protocollo scritto allegato. Infine, preparare il buffer di lisi composto da buffer 1X con l'aggiunta di TRITTON X-100 allo 0,5% e il buffer per precipitazione immuno-magnetica o buffer IP composto da buffer 1X.Aggiungere 0,1% di TRITON X-101 fino a due giorni dopo il seeding; a quel punto, le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, condizione ottimale per il cross-linking. In condizioni di alta confluenza, le cellule tendono ad accumularsi le une sulle altre, riducendo la disponibilità del crosslinker permeabile per tutte le cellule. Rimettere le piastre nell'incubatrice fino al momento del cross-linking.Preparare la soluzione di crosslinker DSP immediatamente prima di applicarla alle cellule. Il DSP è altamente idrofobo e pertanto viene disciolto in DMSO fino a una concentrazione di 100 millimolari prima di essere diluito nel tampone PBS con calcio e magnesio. Per migliorare ulteriormente la diluizione del DSP nel tampone PBS con calcio e magnesio, riscaldare un volume appropriato e aggiungere 10 microlitri della soluzione madre di DSP in DMSO.Per ogni millilitro di PBS caldo con calcio e magnesio, aggiungere la soluzione stock di D-S-P-D-M-S-O goccia a goccia con mescolamento ripetuto fino a quando tutto il DSP si sarà sciolto. Inoltre, preparare una soluzione di controllo veicolare di 10 microlitri di DMSO per ogni millilitro di PBS con calcio e magnesio. Dopo la diluizione del DSP, mantenere tutte le soluzioni di PBS con calcio e magnesio in un bagno di ghiaccio e acqua per non più di 10 minuti.Successivamente, preparare un bagno di acqua e ghiaccio in grado di contenere tutte le piastre utilizzate nell'esperimento. Prelevare quindi le piastre di coltura contenenti le cellule dall'incubatore a 37 gradi Celsius e posizionarle immediatamente nel bagno di acqua e ghiaccio. Lavare le cellule due volte con PBS freddo contenente calcio e magnesio, utilizzando gli stessi volumi preparati in precedenza per l'incubazione con il crosslinker; per una piastra a sei pozzetti, calcolare due millilitri per pozzetto e così via.Dopo il secondo lavaggio, aggiungere il controllo del veicolo, ovvero il DMSO disciolto nel buffer, oppure la soluzione di buffer cross-linkante DSP alle cellule, incubare sul ghiaccio per due ore e controllare ogni circa 20 minuti per assicurarsi che tutte le cellule siano ricoperte dalla soluzione. Se alcune cellule diventano esposte, inclinare e ruotare la piastra per ricoprirle nuovamente in modo uniforme; è normale che una piccola quantità di DSP precipiti.Durante l'incubazione di due ore con le cellule, prima che termini il periodo di incubazione di due ore, preparare una soluzione di quenching 1X DSP diluendo il reagente in PBS privo di calcio e magnesio. Mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso per arrestare la reazione di cross-linking, inattivando lo DSP non reagito. Trascorse le due ore, rimuovere dalle cellule le soluzioni di controllo veicolare e di cross-linking.Aggiungere la soluzione di arresto DSP ghiacciata e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Nel frattempo, diluire il cocktail completo di inibitori delle proteasi 1:50 nel buffer di lisi cellulare. Trascorsi i 15 minuti, lavare le cellule due volte con PBS contenente calcio e magnesio.Quindi aggiungere il buffer di lisi contenente gli inibitori delle proteasi alle cellule e agitare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti di lisi cellulare, utilizzare una spatola per cellule per raccogliere le cellule dalla piastra. Assicurarsi di mantenere i lisati sul ghiaccio per minimizzare l'attività delle proteasi.Centrifugare i lisati cellulari per 15 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco miniatura alla velocità massima di 15.000 G. Pipettare il soprannatante in una provetta nuova e scartare il pellet. Analizzare i livelli proteici utilizzando il saggio di Bradford e procedere con l'immunoprecipitazione. Iniziare a prepararsi per l'immunoprecipitazione immediatamente dopo aver avviato la reazione di cross-linking della durata di due ore in provette microcentrifuga con tappo a vite.Combinare 30 microlitri di microsferette immunomagnetiche anti-IgG con 500 microlitri di buffer IP. Aggiungere l'anticorpo contro l'antigene di interesse. La quantità appropriata di anticorpo deve essere determinata per ciascun antigene specifico.In esperimenti preliminari, possibili controlli negativi per le perle includono l'assenza di anticorpo, perle senza anticorpo e perle con anticorpo di controllo isotipico per legare l'anticorpo IP alle perle magnetiche. Incubare su un agitatore rotante end-over-end per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, effettuare una breve centrifugazione dei tubi e inserirli nel supporto magnetico. Le perle si concentreranno sul lato del magnete.Rimuovere la soluzione contenente gli anticorpi non legati e lavare immediatamente le perle per evitare che si secchino. Dopo due lavaggi, aggiungere 500 microlitri di un microgrammo per millilitro di lisato cellulare negativo per DSP o positivo per DSP nei tubi appropriati. Un controllo negativo con competizione peptidica può essere preparato a questo stadio aggiungendo il peptide immunogeno a una concentrazione determinata in esperimenti preliminari alla miscela di perle e lisato.Un altro possibile controllo negativo che può essere preparato in questa fase è una reazione senza lisato, contenente solo il buffer, preparata aggiungendo 500 microlitri di buffer di lisi solo alle perle. Ripesare delicatamente le perle per le reazioni sperimentali e di controllo. Non vortexare poiché ciò potrebbe causare la rottura delle perle; incubare a quattro gradi con rotazione end-over-end per due ore.Trascorse due ore, rimuovere il lisato utilizzando il supporto magnetico. Eseguire una breve centrifugazione e lavare le perle per un totale di sei volte con un millilitro di buffer IP, incubando ogni lavaggio a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Per eludere i complessi legati, aggiungere un volume di buffer per gel al campione nel tubo di immunoprecipitazione appena sopra il pellet di perline. Per raccogliere le perline sul fondo del tubo, battere delicatamente la base del tubo in modo da riportare tutte le perline in sospensione nel buffer per gel. In alternativa, per l'isolamento mediante affinità immunitaria, utilizzare 30 microlitri di buffer integrato con il peptide immunogeno aggiunto alle perline.La concentrazione richiesta del peptide immunogeno viene determinata empiricamente. Dopo aver testato un intervallo compreso tra 10 e 200 micromolar, incubare le perle a quattro gradi per due ore, agitando i tubi ogni 30 minuti. Utilizzare il supporto magnetico per rimuovere i 30 microlitri contenenti i complessi eluiti e conservarli in un tubo pulito; lavare le perle con il buffer IP e conservarle.Aggiungere un volume di tampone campione gel alle perle per entrambi i metodi di eluizione. Riscaldare le perle immunomagnetiche ri-sospese nel tampone campione gel a 75 gradi Celsius per cinque minuti, oltre a denaturare le proteine. Questo passaggio scinderà anche la molecola DSP, consentendo la risoluzione delle singole proteine nel complesso analizzato.I campioni su un gel SDS-PAGE per il western blotting. Le microsfere magnetiche immunologiche svuotate possono essere allontanate mediante centrifugazione e rimosse dal campione con un portacampioni magnetico prima del caricamento. Se l’EUA di affinità immunologica è priva di IgG sia per mezzo di colorazione proteica dell'SDS-PAGE che mediante immunoblot, è adatta per la spettrometria di massa.Di seguito è riportato un esempio di blotting western di materiale ottenuto da lisati cellulari cross-linkati e non cross-linkati, seguito da precipitazione immuno-magnetica mediante un anticorpo monoclonale contro la subunità delta del complesso AP. Il cross-linking consente la rilevazione di proteine interagenti non visibili nei campioni non cross-linkati durante le isolazioni immuno-magnetiche. I controlli negativi non mostrano un arricchimento specifico di proteine utilizzando un anticorpo assente o un controllo di isotipo abbinato, impiegando un IgG diretto contro il recettore della transferrina sia per i campioni non cross-linkati che per quelli cross-linkati.In questo esempio, è stata utilizzata l'eluzione con peptidi ad affinità per recuperare le proteine legate all'anticorpo di immunoprecipitazione. Si noti che l'anticorpo immuno è assente nella frazione del sopranatante e rimane nella frazione del pellet durante l'eluzione con peptidi. È stato appena illustrato come isolare complessi MultiPro labili utilizzando il crosslinker chimico DSP, seguito da purificazione ad affinità immuno-magnetica.Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere le soluzioni cellulari e i lisati freddi per preservare le interazioni labili durante il cross-linking e per minimizzare l'attività delle proteasi. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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