Name: Hi-C: un metodo per studiare larchitettura tridimensionale dei genomi. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: Impara il metodo Hi-C per studiare l'architettura tridimensionale dei genomi umani. Questa tecnica combina ligazione di prossimità e sequenziamento per identificare interazioni cromatiniche a livello genomico.

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Ringraziamo A. Kosmrlj per le discussioni e il codice; AP Aiden, XR Bao, M. Brennero, D. Cene di Gala, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout , L. Wood, e K. Zeldovich per le discussioni, e L. Gaffney e B. Wong aiuto per la visualizzazione. Sostenuto da un Hertz Fannie e John Foundation laureato borsa di studio, una Difesa Nazionale della Scienza e Ingegneria laureato comunione, una comunione NSF laureato, il National Space Biomedical Research Institute, e non concede. T32 HG002295 dal National Human Genome Research Institute (NHGRI) (EL); i2b2 (Informatica per l&#39;integrazione e la biologia Comodino), il NIH supportato Center for Biomedical Computing presso il Brigham and Women s Hospital (LAM), non concede. HG003143 dal NHGRI, e un Keck Foundation premio insigne studioso giovani (JD). Prime e mappati Hi-C dati di sequenza è stato depositato presso la banca dati GEO ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a> ), l&#39;adesione no. GSE18199. Visualizzazioni aggiuntive sono disponibili all&#39;indirizzo <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a> .

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
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<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
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<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

Un brevetto provvisorio sul metodo Hi-C (n ° 61/100, 151) è in revisione.

Vi presentiamo un metodo di studio del 3-dimensionale architettura del genoma con la mappatura delle interazioni della cromatina in un imparziali, genoma modo. La fase più critica sperimentale ciò che contraddistingue questa tecnologia a parte dal lavoro precedente - è l&#39;incorporazione di nucleotidi biotinilato a limitare le estremità dei frammenti reticolato smussato-end prima di legatura. L&#39;esecuzione di questo passo con successo permette il sequenziamento profondo di tutte le giunzioni legatura, e dà Hi-C la sua portata e la potenza. Il numero di letture in ultima analisi, determina la risoluzione delle mappe di interazione. Qui, un 1 Mb per l&#39;interazione mappa del genoma umano è presentato con ~ 30 milioni regolabile in legge. Al fine di aumentare la risoluzione &#39;per tutti gli usi&#39; di un fattore di n, il numero di letture deve essere aumentato di un fattore di n 2. L&#39;Hi-C tecnica può essere facilmente combinata con altre tecniche, quali la cattura ibridi dopo generazione libreria (per indirizzare parti specifiche del genoma) e immunoprecipitazione della cromatina dopo la legatura (a esaminare l&#39;ambiente cromatina delle regioni associate a specifiche proteine).

<table><tbody><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>Passaggio 1.2</td></tr><tr><td>biotina-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>Passaggio 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>Passaggi 1.6 e 2.2</td></tr><tr><td>Ligasi T4 del DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>Passaggio 1.9</td></tr><tr><td>Polimerasi T4 del DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>Passaggi 1.17 e 2.2</td></tr><tr><td>Tampone per ligazione 10x</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>Passaggi 2.2 e 3.4</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Passaggio 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>Passaggio 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidina C1</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>Passaggio 3.2</td></tr><tr><td>Ligasi T4 del DNA HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>Passaggio 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>Passaggio 3.8</td></tr><tr><td>Perle Ampure</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>Passaggio 3.9</td></tr></tbody></table>

hi-c: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Tridimensionale piegatura dei cromosomi del genoma e suddivide e può portare lontano elementi funzionali, come promotori e stimolatori, in stretta prossimità spaziale 2-6. Decifrare il rapporto tra organizzazione e l&#39;attività dei cromosomi del genoma sarà di aiuto nella comprensione dei processi genomica, come la trascrizione e la replicazione. Tuttavia, poco si sa su come i cromosomi volte. Microscopia è in grado di distinguere un gran numero di loci contemporaneamente o in alta risoluzione. Ad oggi, il rilevamento di interazioni con conformazione cromosomica catturare cromosoma (3C) e la sua successivi adeguamenti necessari alla scelta di una serie di loci bersaglio, rendendo genome-wide studi impossibile 7-10. Abbiamo sviluppato Hi-C, un&#39;estensione della 3C che è in grado di identificare le interazioni a lungo raggio in un imparziali, genoma della moda. In Hi-C, le cellule vengono fissate con formaldeide, causando loci interagendo ad essere legati l&#39;uno all&#39;altro mediante covalente DNA-proteine ​​cross-link. Quando il DNA è frammentato in seguito con un enzima di restrizione, questi loci rimangono collegati. Un residuo biotinilato è incorporato come il 5 &#39;sbalzi sono riempiti in seguito, smussato-end legatura viene effettuata in condizioni di diluire gli eventi che favoriscono la legatura tra reticolato frammenti di DNA. Il risultato è un genoma libreria di prodotti legatura, corrispondenti a coppie di frammenti che erano originariamente in stretta vicinanza l&#39;uno all&#39;altro nel nucleo. Ogni prodotto legatura è contrassegnato con la biotina al sito della giunzione. La biblioteca è tosato, e le giunzioni sono tirato verso il basso con perline streptavidina. Le giunzioni purificato può essere successivamente analizzati utilizzando un elevato throughput sequencer, risultando in un catalogo di frammenti interagenti. Analisi diretta della matrice contatto risultante rivela numerose funzioni di organizzazione genomica, come la presenza dei territori cromosomici e l&#39;associazione preferenziale di piccoli geni ricchi cromosomi. Analisi di correlazione può essere applicata alla matrice di contatto, a dimostrazione che il genoma umano è suddivise in due comparti: un comparto meno densamente contenente cromatina aperta, accessibile e attivo e uno scomparto più denso contenente chiuso, regioni inaccessibili, e inattivi cromatina. Infine, l&#39;analisi d&#39;insieme della matrice di contatto, accoppiato con derivazioni teoriche e simulazioni computazionali, ha rivelato che su scala megabase Hi-C rivela caratteristiche coerenti con una conformazione globulo frattale.

L&#39;Hi-C metodo consente l&#39;identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Il ripiegamento tridimensionale dei cromosomi compartimentalizza il genoma e può avvicinare elementi funzionali distanti, come promotori ed enhancer, ...

Hi.C è un metodo per identificare interazioni cromatiniche a lungo raggio in modo imparziale su scala genomica. Innanzitutto, le cellule vengono fissate con formaldeide, lisate e successivamente il DNA viene frammentato mediante un enzima di restrizione. Successivamente, un residuo biotinilato viene incorporato mentre i prolungamenti a cinque prime vengono riempiti in modo da ottenere estremità ottuse, e viene effettuata una ligazione in condizioni diluite che favoriscono gli eventi di ligazione tra frammenti di DNA cross-linkati.La libreria viene frammentata e le giunzioni sono isolate mediante perle di streptavidina. Le giunzioni purificate possono successivamente essere analizzate utilizzando un sequenziatore ad alto rendimento, ottenendo così un catalogo di frammenti interagenti. Questi risultati ci forniscono informazioni sul ripiegamento della cromatina, rivelando la presenza di territori cromosomici, la compartimentalizzazione del genoma in cromatina aperta e chiusa e prove a sostegno dell'organizzazione Fractal Globule su scala megabase.Ciao, sono Nka Van Bergham del Laboratorio Field Decker del programma di funzione e espressione genica presso la University of Massachusetts Medical School. Ciao, sono Ez Lieberman Aiden del laboratorio di Eric Lander presso il Broad Institute di Harvard e del Massachusetts Institute of Technology. Sono Louis Williams del gruppo di ricerca e sviluppo in biologia molecolare presso il Broad Institute e poi Maxima Mackay del laboratorio di Len Muni presso il Massachusetts Institute of Technology.Oggi vi mostreremo un procedimento per il sequenziamento su scala genomica delle interazioni cromosomiche chiamato high C. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per esplorare sperimentalmente l'architettura del genoma umano. La prima parte del procedimento che vi mostreremo si svolgerà presso la UMass Medical School e la seconda parte verrà eseguita presso il Prude Institute. Vi mostreremo inoltre come abbiamo utilizzato i risultati dell'esperimento high C per simulare la dinamica del genoma al MIT.Iniziamo. Dunque, iniziamo. Ciao, C inizia con l'incrocio dei legami delle cellule, un metodo comune nell'analisi di cattura della conformazione dei cromosomi.Per iniziare, coltivare tra due volte 10 alla sette e 2,5 volte 10 alla sette cellule di mammifero, aderenti o in sospensione, quindi lisare le cellule in 550 microlitri di buffer di lisi utilizzando un omogeneizzatore. Centrifugare la cromatina a 5.000 giri/min e lavare il pellet due volte con 500 microlitri di buffer NEB 2; dividere il campione in cinque provette numerate e aggiungere il buffer B fino a un volume finale di 362 microlitri.Aggiungere attentamente 38 microlitri di una miscela di SDS al 1% e incubare a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Rimettere immediatamente i tubi sul ghiaccio e neutralizzare l'SDS aggiungendo 44 microlitri di Triton X-100 mescolati attentamente con 400 unità di Hindi tre e incubare a 37 gradi Celsius tutta la notte sotto rotazione. I passaggi successivi sono specifici per l'alta C e includono la marcatura delle estremità del DNA con biotina e la ligazione a estremità ottuse dei frammenti incrociati.Questo passaggio permetterà la purificazione dei giunti di ligazione nel successivo tubo. Non si deve eseguire il passaggio di eluizione della biotina e invece si deve utilizzare come controllo tre C per assicurare che le condizioni di digestione e ligazione siano state ottimali per riempire gli sbalzi dei frammenti di restrizione e marcare le estremità del DNA con biotina nei rimanenti quattro tubi. Aggiungere D-A-T-P-D-G-T-P e DTTP ai tubi due fino a cinque.Aggiungere anche DCTP biotinilato e Klino. Mescolare accuratamente e incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, porre i tubi sul ghiaccio, quindi aggiungere 86 microlitri di SDS al 10% in tutti i tubi per inattivare gli enzimi.Incubare i tubi a 65 gradi Celsius per esattamente 30 minuti e posizionarli immediatamente sul ghiaccio. Per favorire gli eventi di ligazione tra frammenti cross-linkati, la ligazione viene eseguita in condizioni estremamente diluite. Lavorando sul ghiaccio, aggiungere 7,61 millilitri di mix di ligazione a ciascuno dei cinque tubi da 15 millilitri.Trasferire quindi ciascuna miscela di cromatina digerita nel rispettivo tubo. Aggiungere 10 microlitri di DNA ligasi T4 al tubo uno per eseguire una normale ligazione 3C. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di DNA ligasi T4 ai tubi da due a cinque per eseguire una ligazione blunt-end high-C.Mescolare i tubi capovolgendoli e incubare per quattro ore a 16 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, degradare le proteine e invertire il cross-linking del CNA aggiungendo 50 microlitri di proteinasi K per ogni tubo e incubando i tubi tutta la notte a 65 gradi Celsius. Aggiungere ulteriori 50 microlitri di proteinasi K per ogni tubo il giorno successivo e continuare l'incubazione a 65 gradi Celsius per altre due ore.Trasferire le miscele di reazione in cinque provette coniche da 50 millilitri. Purificare il DNA in queste provette eseguendo un'estrazione con fenolo. Aggiungere 10 millilitri di fenolo e vortexare per due minuti.Centrifugare i tubi per 10 minuti a 3.500 giri al minuto e trasferire con attenzione la maggior quantità possibile della fase acquosa in un nuovo tubo da 50 millilitri. Ripetere l'estrazione utilizzando fenolo cloroformio e precipitare il DNA mediante etanolo dopo la centrifugazione; ogni pellet di DNA precipitato con etanolo viene risolto in 450 microlitri di tampone 1X TE e trasferito in un tubo da centrifuga da 1,7 millilitri. Un ulteriore ciclo di purificazione viene effettuato eseguendo due estrazioni con fenolo cloroformio usando 500 microlitri di fenolo cloroformio, vorticiare per un minuto, centrifugare i tubi per cinque minuti a 14.000 giri al minuto e trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo dopo la seconda estrazione.Il DNA viene precipitato con etanolo dopo aver centrifugato il DNA precipitato; ogni pellet di DNA viene lavato una volta con etanolo al 70% e quindi risospeso in 25 microlitri di buffer one XT. Degrada qualsiasi RNA presente aggiungendo un microlitro di RNAsi per provetta e incubando le provette per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Raccogli il contenuto ad alto C delle provette da due a cinque, mantenendo sempre la provetta uno separata come controllo tre C.Ora è un buon momento per esaminare la quantità e la qualità delle librerie eseguendo un'aliquote in un gel AASE allo 0,8%, segnando l'efficienza della ligazione di HI C che dovrebbe essere valutata con un saggio di digestione PCR. La creazione di estremità piatte e la ligazione effettuate nella procedura HI C genereranno siti di restrizione per l'endonucleasi in HE uno; frammenti amplificati dalle librerie tre C e high C possono essere digeriti con Hindi tre e NHE uno per determinare quanto bene siano state generate le estremità piatte e alcuni frammenti non saranno stati ligati. Rimuovere la biotina da queste estremità non ligate utilizzando l'attività esonucleasica della DNA polimerasi T quattro come descritto nel protocollo scritto.Purificare nuovamente il DNA utilizzando l'estrazione con fenolo-cloroformio e la precipitazione con etanolo, quindi risospendere i pellet di DNA in un volume totale di 100 microlitri di acqua. Se il campione ha superato i saggi di controllo qualità, il protocollo prosegue con il bio timple down e il sequenziamento. Grazie.Per rendere il DNA BIOTINILATO adatto al sequenziamento ad alto rendimento, il DNA deve essere frammentato a una dimensione compresa tra 300 e 500 paia di basi utilizzando uno strumento CAVAS S due. I frammenti di DNA vengono riparati aggiungendo tampone 10 x, DNTPS, DNA polimerasi T4, chinasi polinucleotidica T4, DNA polimerasi priva di attività esonucleasica e acqua; quindi si incubano i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, si utilizza una colonna Kaya Gym MinLu per purificare il DNA seguendo le raccomandazioni del produttore. Dopo aver caricato il DNA sulla colonna e averla lavata, eluire il DNA due volte con 50 microlitri di tampone 1 XTLE; successivamente, aggiungere DATP all'estremità 3' del DNA riparato aggiungendo tampone NEB 10 X, due DATP, acqua e frammento ciliare privo di esonucleasi.Incubare la reazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius per inattivare il frammento cile. Incubare le reazioni per 20 minuti a 65 gradi Celsius e successivamente raffreddare le reazioni sul ghiaccio utilizzando un evaporatore sotto vuoto, riducendo i volumi delle reazioni a 20 microlitri. Successivamente, caricare il DNA su un gel di agarosio all'1,5% in 1X TAE e farlo correre per 3,5 ore a 80-90 V.Asportare i frammenti di DNA compresi tra 300 e 500 paia di basi e purificarli utilizzando un kit di estrazione da gel Qiagen, impiegando da due a quattro colonne a seconda del peso del gel. Unire gli eluiti gialli dalle colonne Kayak Quick e portare il volume finale a 300 microlitri con buffer 1X TLE. Infine, determinare la concentrazione di DNA mediante il saggio QU utilizzando il qubit e calcolare la quantità totale di DNA in questa sezione del protocollo.I giunzioni di ligazione vengono purificate dal pool di DNA, consentendo un'efficiente identificazione dei frammenti di cromatina interagenti mediante sequenziamento a estremità accoppiate. Eseguire tutti i passaggi successivi in provette a bassa adesione per DNA. Preparare le perle per la biotina.Eseguire la precipitazione lavando 150 microlitri di perle magnetiche di streptavidina A sospese due volte con 400 microlitri di buffer al 1x di Tween. Queste operazioni di lavaggio successive prevedono cinque passaggi: aggiunta del buffer alle perle, trasferimento della miscela in un nuovo tubo, rotazione del campione per tre minuti a temperatura ambiente e recupero delle perle mediante un concentratore di particelle magnetiche.Sto rimuovendo il supinate reus. Diluire i microsferini in 300 microlitri di tampone 2x senza tween e unire a 300 microlitri di cDNA alto. Lasciare che il cDNA marcato con biotina si leghi alle microsferine di streptavidina mediante incubazione della miscela a temperatura ambiente per 15 minuti con rotazione.Raccogliere il DNA legato allo strp A nelle perle mediante un concentratore di particelle magnetiche e rimuovere il soprannatante. Lavare le perle con 400 microlitri di buffer 1x senza tween, seguiti da 100 microlitri di buffer di ligazione 1x. Risospendere le perle in 50 microlitri di buffer di ligazione 1x e trasferire la miscela in un nuovo tubo.Per preparare il DNA per il sequenziamento paired-end Illumina, prendere la quantità totale di DNA inserita dall'utente per il pull-down con biotina, calcolata in precedenza mediante il saggio di quantificazione, e dividerla per 20 per stimare la quantità di cDNA ad alta complessità che è stata arricchita ed è disponibile per la ligazione. Aggiungere sei P OLS di adattatori Illumina paired-end per microgrammo di cDNA ad alta complessità disponibile per la ligazione. Utilizzare 1.200 unità di ligasi T4 del DNA per legare gli adattatori al DNA.Incubare per due ore a temperatura ambiente. Rimuovere gli adattatori a estremità unite non legati recuperando le perle a cui è legato l'acido desossiribonucleico complementare ad alta efficienza e lavando le perle due volte con 400 microlitri di buffer una x contenente tween. Lavare le perle con 200 microlitri di buffer una x senza tween, seguito da 200 microlitri e poi da 50 microlitri di buffer una XNEB.Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di buffer NEB 2 e trasferirle in un nuovo tubo. Per determinare il numero di cicli necessari per generare una quantità sufficiente di prodotto PCR per il sequenziamento.Impostare quattro reazioni PCR di prova con 6, 9, 12 o 15 cicli. Determinare il numero ottimale di cicli eseguendo le reazioni PCR su un gel di poliacrilammide al 5% e colorando con cyber green, assicurandosi dell'assenza di bande spurie e della presenza di uno smear compreso tra 400 e 600 pa, che corrisponde alla lunghezza dei prodotti comuni dopo la ligazione agli adattatori; amplificare il resto della libreria ad alta complessità dopo l'elusione, utilizzando le perle in una PCR su larga scala con il numero ottimale di cicli PCR. Recuperare i prodotti PCR dai pozzetti separati e riottenere le perle.Mantenere l'1% dei prodotti PCR su larga scala separato per eseguirne l'elettroforesi su gel e purificare il resto del prodotto PCR con un volume pari a 1,8 volte quello del campione e perle pure, seguendo le raccomandazioni del produttore. Eluire il DNA con 50 microlitri di buffer one XTLE e confrontare l'1% del prodotto PCR purificato con perle PU con l'1% dell'aliquote del prodotto PCR originale su un gel di poliacrilammide al 5%. Per verificare la corretta rimozione della sequenza dei primer PCR, la libreria ad alta complessità per il sequenziamento paired-end Illumina allinea ciascuna estremità in modo indipendente utilizzando MAC per identificare i frammenti di cromatina in interazione.I seguenti risultati sono quelli attesi quando il protocollo high C viene eseguito correttamente dal punto di vista tecnico e possono essere considerati standard di controllo di qualità. I passaggi di controllo di qualità dovrebbero mostrare che sia le librerie three C che quelle high C si separano come bande piuttosto strette di dimensioni superiori a 10 chilobasi. Una strisciata di DNA indica una scarsa efficienza di ligazione.Tipicamente, l'efficienza della ligazione è leggermente inferiore in una libreria ad alto contenuto di C rispetto a un template con tre C. L'elevata marcatura di C e l'efficienza di ligazione possono essere stimate mediante digestione di un prodotto PCR con tre C. Le giunzioni con tre C vengono tagliate da Hindi tre e non da NHE uno.L'inverso è vero per le giunzioni ad alta C. Questo saggio di digestione PCR mostra che il 70% degli ampliconi ad alta C viene tagliato da NHE uno e non da HI Hindi.Tre. Per confermare un'efficace marcatura delle giunzioni di ligazione, l'analisi delle letture sequenziate deve mostrare che le letture provenienti da interazioni intra-cromosomiche e inter-cromosomiche, indicate rispettivamente dalle linee blu e rosse, si allineano significativamente più vicino ai siti di restrizione Hindi tre rispetto alle letture generate casualmente, mostrate in verde.In un esperimento di successo, il 55% delle coppie di letture allineabili rappresenta interazioni intercromosomiche. Il 15% rappresenta interazioni intracromosomiche tra frammenti distanti meno di 20 chilobasi, e il 30% sono coppie di letture intracromosomiche distanti più di 20 chilobasi. Questa distribuzione può essere campionata prima del sequenziamento ad alto rendimento come forma di controllo di qualità.Il clonaggio e il sequenziamento Sanger di circa 100 cloni sono generalmente sufficienti. Le interazioni della cromatina possono essere visualizzate come una mappa termica in cui gli assi x e Y rappresentano l'ordine genomico a bassa risoluzione e ogni pixel rappresenta il numero di interazioni osservate tra di essi. Tipicamente, frammenti di DNA che sono molto vicini tra loro nel genoma lineare tenderanno a interagire frequentemente l'uno con l'altro.Questo si osserva nelle mappe intra-cromosomiche o nelle mappe termiche come una diagonale evidente. I risultati seguenti mostrano diversi modi di analizzare i dati per rivelare vari livelli di organizzazione del genoma. Riportando graficamente la probabilità di contatto in funzione della distanza genomica si osserva che la probabilità di contatto diminuisce in funzione della distanza genomica, raggiungendo infine un plateau a ogni distanza.Le interazioni intracromosomiche indicate con la linea continua sono arricchite rispetto alle interazioni intercromosomiche rappresentate dalle linee tratteggiate. Ciò implica direttamente la presenza di territori cromosomici: il calcolo del numero osservato rispetto a quello previsto di contesti intercromosomici tra tutte le coppie di cromosomi rivela un'associazione preferenziale tra particolari coppie di cromosomi. I piccoli cromosomi ricchi di geni interagiscono preferenzialmente tra loro, come indicato dal colore rosso brillante.È anche possibile esaminare singoli cromosomi. La mappa termica grezza può essere corretta utilizzando una mappa termica attesa, per tenere conto della distanza genomica tra coppie di loci, ottenendo così una mappa termica di osservato su atteso. Successivamente, una matrice di correlazione può essere generata correlando righe e colonne delle mappe termiche di osservato su atteso.Utilizzando l'analisi di correlazione, si è dimostrato che il genoma umano si suddivide in due compartimenti. Questo è illustrato dal motivo a scacchiera. Nelle mappe termiche di correlazione ottenute con dati ad alta C, sono stati ottenuti nuovi approfondimenti sulla piegatura della cromatina a scala megabase.Un modello polimerico ordinario della compattazione della cromatina suggerirebbe che la cromatina si impacchetta in un equilibrio GLO. La rappresentazione della probabilità di contatto in funzione della distanza illustra che la probabilità di contatto scala secondo una legge di potenza con la distanza genomica, il cui coefficiente angolare è approssimativamente pari a meno uno. Questo comportamento non è coerente con quello di un GLO in equilibrio, ma corrisponde alle previsioni per una struttura alternativa nota come GLO frattale. Qui vengono mostrate due strutture regolari.La colorazione corrisponde alla distanza da un estremo, che varia dal blu al verde ciano, giallo, arancione e rosso. E come nei globuli di equilibrio, i globuli frattali sono privi di intrecci in un globo frattale. I loci vicini lungo il contorno tendono a essere vicini anche in 3D, portando alla presenza di blocchi monocromatici.Tali blocchi non si trovano nel Glo di equilibrio. La mancanza di intrecci può essere dimostrata anche rimuovendo la forza che vincola i globuli e permettendo ai globuli di espandersi: il Glo frattale si decondensa rapidamente. Al contrario, il Glo di equilibrio non lo fa perché è troppo intrecciato.Abbiamo appena mostrato come preparare una libreria high C per l'analizzatore. Durante questa procedura, è importante ricordare di eseguire i controlli appropriati per garantire una ligazione e una purificazione efficienti del high C. Il numero di letture determinerà in ultima analisi la risoluzione delle mappe di interazione.Abbiamo utilizzato circa 30 milioni di letture per generare mappe di interazione del genoma umano con una risoluzione di circa un megabase. Per aumentare la risoluzione di un fattore N, il numero di letture deve essere incrementato di un fattore pari a N al quadrato. Spero che vi divertiate ad apprendere la struttura del genoma umano.Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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