Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

In questo video, viene eseguito uno screening ad alto contenuto basato su immagini per valutare la modulazione basata su piccole molecole del fattore di crescita dei fibroblasti: percorso della mappa chinasi Rasm Negli embrioni di pesce zebra, i maschi transgenici e le femmine di pesce zebra di tipo selvatico vengono accoppiati in una gabbia di riproduzione. Le uova fecondate cadono sul fondo e vengono raccolte e trasferite in una capsula di Petri. Gli embrioni vengono incubati durante la notte, quindi posti in pozzetti individuali di una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti.

La piccola molecola BCI viene aggiunta per iperattivare la segnalazione FGF e la piastra viene incubata per sei ore. Le immagini di ciascuna volontà vengono catturate con un lettore di piastre confocali e analizzate utilizzando un algoritmo auto-progettato che riporta le intensità fluorescenti in specifiche strutture embrionali. Ciao, sono Hiba Kado del laboratorio del Dr.Michael Chang presso il Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare dell'Università di Pittsburgh.

Ciao, sono Andrea Spock dell'Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute. Oggi vi mostreremo la procedura per l'allevamento, la selezione e l'organizzazione degli embrioni di pesce zebra per il trattamento chimico. In una piastra a 96 pozzetti, utilizzeremo embrioni transgenici che riportano l'attività del fattore di crescita in fibra di vetro e trattati con una molecola che iperattiva questo passato bianco.

Ti mostreremo come utilizziamo la metodologia di screening ad alto contenuto per acquisire, analizzare e quantificare automaticamente l'attività del fattore di crescita dei fibroblasti negli embrioni di pesce zebra transgenico. Questa procedura evidenzierà la tecnologia della piattaforma per l'utilizzo di pesci zebra transgenici e schermi chimici ad alto rendimento. Quindi iniziamo.

Due giorni prima del trattamento, identificare i pesci zebra transgenici maschi omozigoti e metterli in vasche di accoppiamento individuali. Aggiungi separatori alle vasche, quindi aggiungi un pesce femmina di tipo selvatico a ciascuna vasca e lascia il pesce nelle gabbie di accoppiamento durante la notte a 28 gradi Celsius. La mattina dopo, rimuovere il separatore Dopo un'ora, spostare il pesce in una nuova vasca e versare gli embrioni in un setaccio di plastica.

Trasferire gli embrioni in piastre da 100 millimetri con una soluzione E tre e incubare a 28 gradi Celsius per sei-otto ore. Dopo l'incubazione, esaminare gli embrioni al microscopio stereoscopico. Gli embrioni adatti agli esperimenti saranno sottoposti a gas.

A questo punto, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati, che rimarranno allo stadio di singola cellula. Inoltre, rimuovere gli embrioni non vitali che appaiono opachi o malformati. Quindi aggiungere la soluzione fresca di E tre e incubare per una notte a 28 gradi Celsius.

Il giorno successivo, metti gli embrioni sotto uno stereomicroscopio fluorescente per ordinare gli embrioni transgenici per uno stadio simile e uniforme. Espressione GFP 24 embrioni HPF mostrano un confine visibile nel cervello medio posteriore con un'intensa espressione di GFP e occhi ben formati con retine dorsali GFP positive. Questi embrioni sono attivi e si muoveranno e si dimeneranno nel loro corion usando una pipetta di plastica da pascolo.

Trasferire i 24 embrioni HPF uno alla volta in pozzetti individuali di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere l'eventuale eccesso di soluzione di E tre dai pozzetti. Quindi, utilizzando un pipettatore multicanale, aggiungere 200 microlitri di soluzione E tre a ciascun pozzetto.

Quindi, aggiungere due microlitri di DMSO a tutti i pozzetti nelle colonne uno e 12. Quindi aggiungere due microlitri di BCL preparato in DMSO come segue, uno, micromolare alle colonne due e sette. Cinque micromolari a tre e otto, 10 micromolari a quattro e nove 20.

Micromolare alle colonne cinque e 10. E infine 25 micromolari alla colonna sei e 11. Ora copri la piastra con un foglio di alluminio e incubala per sei ore a 28 gradi Celsius.

Aggiungere 10 microlitri di trica in ogni pozzetto per anestetizzare i 30 embrioni HPF. Quindi caricare la piastra nei dispositivi molecolari image express ultra open meta express software. Scegli una configurazione con un obiettivo Forex e un diametro massimo del foro stenopeico.

Configura la messa a fuoco automatica del laser per rilevare il fondo della lastra e utilizzare un offset Z ottimale predeterminato. Per rilevare le regioni di interesse, impostare l'area di scansione come un singolo sito di 2000 x 2000 pixel senza benning. Selezionare il tipo di piastra appropriato e il laser ad argon da 488 nanometri all'eccitazione su lunghezze d'onda di emissione di 488 su 525 nanometri.

Quindi selezionare un pozzetto contenente un embrione trattato con veicolo e fare clic su Trova campione. Lo strumento eseguirà una scansione con messa a fuoco automatica e acquisirà una singola immagine per confermare la corretta acquisizione dell'immagine. Seleziona casualmente un veicolo trattato bene e acquisisci un'immagine.

Se l'immagine è a fuoco e mostra l'espressione GFP nella testa. Posizionare il cursore sulle aree più luminose e verificare che l'intensità della fluorescenza rientri nell'intervallo della fotocamera a 16 bit. Meno di 65.000 unità.

Ripetere questi passaggi con un altro controllo del veicolo e alcuni pozzetti trattati con composto. Se necessario, regolare la potenza e il guadagno del laser in modo tale che le regioni più luminose nelle immagini di controllo positivo non si saturino. Successivamente, nella finestra di acquisizione e controllo delle lastre, scegliere Acquisisci lastra per avviare la scansione delle lastre.

Lo strumento acquisirà automaticamente un'immagine per pozzetto per l'intera micropiastra e le archivierà in un database SQL Server. Una volta terminata la scansione, carica le immagini in D definition. Sviluppatore aprendo sviluppatore con l'opzione fionda abilitata.

Creare una nuova area di lavoro. Quindi, dal menu File, seleziona l'importazione personalizzata. Quindi, vai alla cartella contenente le immagini e apri un file di esempio.

Scegli un filtro di importazione che riconosca il formato dell'immagine e la struttura dei file generati dalla piattaforma Image Express Ultra dei dispositivi molecolari. Ora per elaborare le immagini, apri un'immagine di controllo e carica la tecnologia di rete cognitiva desiderata o l'algoritmo CNT o il set di regole. L'algoritmo personalizzato utilizzato qui è progettato per identificare automaticamente l'embrione, il tuorlo e la testa e per quantificare la luminosità e l'area delle strutture della testa che esprimono GFP, eseguire la regola impostata sulla fase di rilevamento della testa e del tuorlo.

Per garantire la corretta assegnazione del sacco vitellino e della testa, modificare il set di regole per regolare la soglia di rilevamento del tuorlo se il tuorlo è troppo grande o troppo piccolo. Quindi, esegui il set di regole per la fase di rilevamento delle strutture della testa luminosa. Per garantire la corretta assegnazione delle aree che esprimono GFP nella testa, modificare il set di regole per regolare la soglia di rilevamento delle strutture della testa come multipli dell'intensità umile fino a quando il rilevamento delle strutture luminose della testa non corrisponde all'osservazione visiva.

Successivamente, esegui manualmente l'intero set di regole su diverse immagini scelte casualmente generate da embrioni trattati con veicolo e immagini di controllo positivo da embrioni trattati con PCI. Per eseguire l'algoritmo su tutte le immagini delle lastre, selezionare le lastre da analizzare e scegliere. Analizza, quindi passa al set di regole ottimizzato e analizza tutti i pozzetti.

Utilizzando il pianificatore di lavori integrato, i pozzetti vuoti o le immagini ambigue verranno automaticamente esclusi dall'analisi durante la scansione. Viene visualizzata una mappa di mantenimento in continuo aggiornamento. Sia i dati che le immagini sono accessibili durante la corsa per l'ispezione visiva.

I dati numerici e le immagini elaborate vengono salvati automaticamente. Dopo che tutte le immagini sono state analizzate, i dati possono essere esportati in software di terze parti come Excel, GraphPad o prism. Questa figura mostra le immagini di scansione archiviate da un veicolo trattato e da un BCI trattato bene con e senza analisi CNT.

La proteina fluorescente verde applicata o GFP viene rilevata nell'occhio, nel limite cerebrale posteriore medio e nei gangli del trigemino di embrioni transgenici. Si noti che sia l'intensità della GFP che i domini di espressione sono espansi. Negli embrioni trattati con BCI, si osserva un effetto dose-dipendente dell'ICB sull'espressione del gene reporter GFP negli embrioni transgenici.

La concentrazione richiesta per suscitare una risposta semimassimale o EC 50 era di circa 12 micromolari. Vi abbiamo appena mostrato come allevare, raccogliere e organizzare embrioni di pesce zebra transgenico in piastre a 96 pozzetti. Abbiamo aggiunto una crescente concentrazione di PCI nel proprio attivatore della via di segnalazione.

Abbiamo anche mostrato come automatizzare l'imaging di embrioni transgenici e abbiamo analizzato le immagini con un algoritmo progettato su misura basato sulla tecnologia della rete cognitiva. Con questo approccio, siamo stati in grado di misurare quantitativamente in modo graduato gli effetti di una piccola molecola attivatrice della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere attentamente gli embrioni per ridurre al minimo la variabilità tra i campioni.

Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.