Name: Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri l'imaging automatizzato e l'analisi chimica per screening su zebrafish. Questo metodo misura gli effetti dose-dipendenti di BCI sulla segnalazione FGF, facilitando screening ad alto rendimento su embrioni transgenici di Danio rerio.

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Questo lavoro è finanziato dal NICHD / NIH (1R01HD053287) per Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) per Vogt, e NHLBI / NIH (1R01HL088016) per Tsang.

1) Impostare accoppiamenti zebrafish e trattamento BCI. <ol><li> Due giorni prima del trattamento, identificare omozigoti maschi Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 zebrafish e luogo singolarmente in vasche di accoppiamento 1. Aggiungi separatore e un tipo di pesce selvatico AB * femminile e lasciare in gabbie di accoppiamento durante la notte. </li><li> La mattina seguente togliere il separatore e raccogliere embrioni dopo 1 ora. Trasferimento degli embrioni a 100 mm con piatti E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), soluzione e incubare a 28 ° C per 6 ore. Rimuovere morto e non fecondate embrioni, aggiungere soluzione fresca E3, e incubare una notte. </li><li> Ordina embrioni transgenici per equivalente stadio (24hpf) e di espressione GFP uniforme. Embrioni Array individualmente in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Rimuovere l'eccesso di soluzione E3 con una micropipetta. Aggiungere 200μl di soluzione E3 con un pipettatore multicanale in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere i seguenti composti elencati: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Concentrazioni finali sono 1μM, 5 micron, 10μM, 20μM, BCI 25 micron in 1% di DMSO. Piastra di copertura in fogli di alluminio e incubare per 6 ore a 28 ° C. </li></ol> 2) imaging automatico di piastre a 96 pozzetti e analisi. <ol><li> Aggiungere 10μl di tricaine (0.61mM) in ciascun pozzetto per anestetizzare gli embrioni 30hpf. </li><li> Piatto di carico in Molecular Devices ImageXpress Ultra. </li><li> Aprire Metaxpress software. Scegliere una configurazione con un obiettivo 4x e diametro massimo foro stenopeico, configurare laser messa a fuoco automatica per rilevare fondo piatto, e determinare ottimale Z-piano per rilevare le regioni di interesse. Acquisire immagini a eccitazione / emissione di lunghezze d'onda di 488/525 nm (GFP). Impostare la scansione area come un unico sito di 2000x2000 pixel (4 x 4 mm) senza binning. Configurare potenza del laser e guadagno in modo che le regioni più luminose nelle immagini di controllo positivo non saturare. Confermare l'acquisizione corretta di immagini in diversi pozzetti di controllo positivi e negativi. </li><li> Avviare la scansione piatto. Lo strumento automaticamente acquisire immagini da tutti i pozzetti e archiviarli in un database SQL Server. </li><li> Caricare immagini in Developer Definiens utilizzando il modulo applicativo Cellenger e un filtro di importazione che riconosce il formato di immagine e la struttura del file generato dalla piattaforma Molecular Devices ImageXpress Ultra. </li><li> Elaborare le immagini con un algoritmo progettato Technology Network Cognizione (designato anche un insieme di regole). L'algoritmo che abbiamo sviluppato in base personalizzati su un insieme di regole recentemente pubblicato 2, è stato progettato per identificare automaticamente embrione, tuorlo, e la testa, e di quantificare la luminosità e la zona di GFP che esprimono le strutture testa. Wells in cui viene rilevato nessun embrione o in cui la testa non può essere assegnato senza ambiguità (ad esempio, con tossicità composto alta o immagini sfocate) sono esclusi dall'analisi. Configurare l'algoritmo utilizzando diverse immagini di controllo negativo (veicolo trattati) e le immagini di controllo positivo (BCI trattati) in modo tale che la testa e tuorlo sono identificati correttamente in entrambi. Impostare una "testa di strutture" soglia di rilevamento come multipli di intensità medio tuorlo fino rilevamento di strutture testa brillanti partite osservazione visiva. Definire i parametri per l'esportazione. In questo esempio, il parametro più informativo è stata la luminosità totale integrata di GFP-positive regioni all'interno della testa, di seguito definito "totale luminosità testa strutture" (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"> Figura 1 Grafico depicitng gli effetti dose-dipendente della BCI sull'espressione GFP negli embrioni transgenici. </li><li> Eseguire l'algoritmo su tutte le immagini utilizzando la piastra integrata job scheduler. Il software Definiens utilizza il calcolo distribuito su diversi processori ("motori"), che consente l'analisi simultanea di più immagini. L'algoritmo calcola le misure numeriche sulla base dei risultati della analisi delle immagini, che vengono salvati nel database insieme ad una copia dell'immagine trattati, con l'analisi applicata. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Dopo tutte le immagini sono analizzate, i dati possono essere visualizzati all'interno Cellenger o esportati a software di terze parti (Excel, GraphPad Prism) per ulteriori analisi e di rappresentazione grafica. La figura 2 mostra le immagini archiviate scansione da un veicolo e un trattato BCI-trattati bene, con e senza CNT analisi applicata. La figura 1 documenta un effetto dose-dipendente della BCI sull'espressione genica giornalista GFP nel Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embrioni. La concentrazione di richieste per provocare una risposta mezzo massimo (EC50) è stato di circa 12 micron. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 2"> Figura 2 Immagine di acquisizione automatica e l'analisi di embrioni di zebrafish transgenico. (A) veicolo DMSO trattati Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 embrione a 30hpf. (B) gli embrioni transgenici trattati con spettacolo 20μM BCI aumenti di espressione GFP. (C) Immagine di embrione da (A) dopo l'esecuzione Definiens insieme di regole per trovare espressione GFP nella testa. Macchie arancione indicano dove il software misura l'intensità GFP. (D) Immagine di embrione da (B) dopo l'esecuzione Definiens insieme di regole per trovare espressione GFP nella testa. Macchie arancione indicano dove il software misura l'intensità GFP. Si noti che l'insieme di regole è stata in grado di trovare uno spazio allargato di espressione GFP nell'embrione trattati.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Un fattore importante che limita la velocità di schermi chimici zebrafish è la mancanza di una metodologia per elaborare sistematicamente le piastre a 96 pozzetti per l&#39;imaging e analisi. Poiché le immagini degli organismi multicellulari sono complessi, a basso contrasto, e di natura eterogenea, esistenti algoritmi di analisi delle immagini non riescono a individuare e quantificare le strutture specifiche all&#39;interno dell&#39;organismo. La maggior parte pubblicati schermi chimici zebrafish quindi coinvolgere l&#39;esame visivo di singoli pozzi da parte di personale dedicato tutta la procedura. Questo impedisce che di solito la generazione di letture numeriche e una completa archiviazione delle immagini dello schermo e dati. Inoltre, la valutazione manuale eliminates alcuni vantaggi chiave di image-based di screening, cioè la capacità di condurre analisi retrospettive di prestazioni dello schermo, per esaminare i cambiamenti fenotipici che non erano l&#39;obiettivo primario della campagna di screening (per esempio, la tossicità o difetti di sviluppo) e di attraversare di riferimento dei dati di screening con schermi passate o future utilizzando la stessa libreria composto. In questo rapporto si evidenzia la metodologia per l&#39;imaging e l&#39;analisi automatizzata di embrioni di zebrafish in piastre a pozzetti multipli senza l&#39;intervento dell&#39;utente. Noi la cattura delle immagini automatico su un laser a scansione confocale ImageXpress Ultra lettore (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) per l&#39;immagine Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embrioni in 96 pozzetti e sviluppato un algoritmo di analisi di immagine basato sulla tecnologia Cognizione Definiens &#39;di rete che GFP quantificati espressione nelle teste degli embrioni transgenici. Il metodo consegnato risposte classificato e quantificato in vivo di una piccola molecola attivatore di FGF segnalazione. Risultati simili sono stati ottenuti con l&#39;epifluorescenza a base ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) documenta che è possibile implementare la cattura automatica delle immagini di embrioni di zebrafish su una varietà di lettori di piastre in commercio 2. Lo sviluppo della metodologia per analizzare automaticamente le immagini organismo pluricellulare eliminato la necessità di segnare visivo da un osservatore umano e ha permesso la generazione e l&#39;archiviazione di dati numerici e immagini per l&#39;analisi retrospettiva e confronti con schermi futuro.

<table><tbody><tr><td>Tricaina (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Dimostriamo l&#39;applicazione di image-based di alto contenuto di screening (HCS) metodologia per identificare piccole molecole in grado di modulare l&#39;FGF / RAS / MAPK in embrioni di zebrafish. L&#39;embrione di zebrafish è un sistema ideale per in vivo di alto contenuto schermi chimici. L&#39;1-day embrione è di circa 1 mm di diametro e può essere facilmente disposte in piastre a 96 pozzetti, un formato standard per lo screening ad alto rendimento. Durante il primo giorno di sviluppo, gli embrioni sono trasparenti con la maggior parte dei principali organi presenti, permettendo così la visualizzazione della formazione di tessuto durante l&#39;embriogenesi. La completa automazione degli schermi chimici zebrafish è ancora una sfida, tuttavia, in particolare nello sviluppo di acquisizione delle immagini e analisi automatizzate. Abbiamo generato in precedenza una linea giornalista transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di attività FGF e dimostrato la loro utilità negli schermi chimici<sup&gt; 1</sup&gt;. Per stabilire la metodologia per schermi ad alta velocità intero organismo, abbiamo sviluppato un sistema automatizzato per l&#39;imaging e l&#39;analisi di embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in piastre da 96 pozzetti<sup&gt; 2</sup&gt;. In questo video possiamo evidenziare le procedure per arraying embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli a 24hpf e l&#39;aggiunta di una piccola molecola (BCI) che hyperactivates FGF segnalazione<sup&gt; 3</sup&gt;. Le piastre vengono incubate per 6 ore seguita dall&#39;aggiunta di tricaine per anestetizzare le larve prima di imaging automatizzato su un Molecular Devices ImageXpress Ultra scansione laser confocale HCS lettore. Le immagini vengono elaborate da un software Developer Definiens utilizzando un algoritmo di rete Cognition La tecnologia che abbiamo sviluppato per individuare e quantificare l&#39;espressione di GFP nelle teste degli embrioni transgenici. In questo esempio si segnala la capacità dell&#39;algoritmo di misura dose-dipendente della BCI effetti sull&#39;espressione dei geni GFP giornalista negli embrioni trattati.

Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l&#39;imaging e l&#39;analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull&#39;espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Dimostriamo l'applicazione della metodologia di screening ad alto contenuto (HCS) basato su immagini per identificare piccole molecole in grado di modulare la via FGF/RAS/MAPK...

In questo video viene eseguita una schermata ad alto contenuto basata su immagini per valutare la modulazione mediata da piccole molecole della via di segnalazione della chinasi della mappa del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti in embrioni di pesce zebra. Pesci zebra transgenici maschi e femmine selvatiche vengono accoppiati in una gabbia di riproduzione. Le uova fecondate cadono sul fondo e vengono raccolte e trasferite in una piastra di Petri. Gli embrioni vengono incubati durante la notte, quindi posizionati in pozzetti singoli di una piastra rotonda a 96 pozzetti.Viene aggiunta la molecola di piccole dimensioni BCI per iperattivare la segnalazione FGF e la piastra viene incubata per sei ore. Le immagini di ogni pozzetto vengono acquisite mediante un lettore di piastre confocale e analizzate utilizzando un algoritmo progettato autonomamente, che riporta le intensità fluorescenti in specifiche strutture embrionali. Ciao, sono Hiba Kado del laboratorio del Dott. Michael Chang del Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare dell'Università di Pittsburgh.Ciao, sono Andrea Spock dell'Istituto per la Scoperta di Farmaci dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo la procedura per l'allevamento, la selezione e il posizionamento in piastra di embrioni di pesce zebra per il trattamento chimico. In una piastra a 96 pozzetti, utilizzeremo embrioni transgenici che segnalano l'attività del fattore di crescita del fibroblasto e li tratteremo con una molecola che iperattiva questa via.Vi mostreremo come utilizziamo la metodologia di screening ad alto contenuto per acquisire, analizzare e quantificare automaticamente l'attività del fattore di crescita dei fibroblasti in embrioni di pesce zebra transgenici. Questa procedura metterà in evidenza la tecnologia di piattaforma per l'utilizzo di pesci zebra transgenici e schermate chimiche ad alto rendimento. Cominciamo dunque.Due giorni prima del trattamento, identificare i pesci zebra transgenici maschi omozigoti e posizionarli in singoli acquari per l'accoppiamento. Aggiungere separatori nei contenitori, quindi aggiungere un pesce femmina di tipo selvatico in ciascun acquario e lasciare i pesci nelle gabbie di accoppiamento durante la notte a 28 gradi Celsius. La mattina seguente, rimuovere il separatore. Dopo un'ora, spostare i pesci in un nuovo contenitore e versare gli embrioni in un colino di plastica.Trasferire gli embrioni in piastre da 100 millimetri con soluzione E3 e incubare a 28 gradi Celsius per sei-otto ore. Dopo l'incubazione, esaminare gli embrioni al microscopio stereoscopico. Gli embrioni adatti per gli esperimenti saranno in fase di gastrulazione.In questo momento, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati, che rimarranno allo stadio di singola cellula. Inoltre, rimuovere gli embrioni non vitali che appaiono opachi o malformati. Quindi aggiungere soluzione E tre fresca e incubare tutta la notte a 28 gradi Celsius.Il giorno successivo, posizionare gli embrioni sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza per selezionare gli embrioni transgenici in stadio simile e con espressione uniforme di GFP. A 24 HPF, gli embrioni mostrano un evidente confine tra mesencefalo e romboencefalo, con intensa espressione di GFP e occhi ben formati con retine dorsali positive per GFP. Questi embrioni sono attivi e si muoveranno e contorceranno all'interno della coriona utilizzando una pipetta Pasteur di plastica.Trasferire un embrione alla volta a 24 HPF in pozzetti singoli di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere la soluzione E tre in eccesso dai pozzetti. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri di soluzione E tre in ogni pozzetto.Successivamente, aggiungere due microlitri di DMSO in tutti i pozzetti delle colonne uno e 12. Quindi aggiungere due microlitri di BCL preparato in DMSO come segue: uno micromolare nelle colonne due e sette, cinque micromolari nelle colonne tre e otto, 10 micromolari nelle colonne quattro e nove, 20 micromolari.Da micromolare a colonne cinque e dieci. E infine 25 micromolari alla colonna sei e undici. Ora coprire la piastra con pellicola di alluminio e incubare per sei ore a 28 gradi Celsius.Aggiungere 10 microlitri di trica in ogni pozzetto per anestetizzare gli embrioni a 30 HPF. Successivamente, caricare la piastra nel software molecolare devices image express ultra open meta express. Scegliere una configurazione con un obiettivo Forex e il diametro massimo del diaframma a spillo.Configurare l'autofocus laser per rilevare il fondo della piastra e utilizzare un offset Z ottimale predeterminato. Per rilevare le regioni di interesse, impostare l'area di scansione come un singolo sito di 2000 per 2000 pixel senza sovracampionamento. Selezionare il tipo di piastra appropriato e il laser all'argon a 488 nanometri con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente a 488 e 525 nanometri.Quindi selezionare una pozzetta contenente un embrione trattato con il veicolo e fare clic su "trova campione". Lo strumento eseguirà una scansione di messa a fuoco automatica e acquisirà una singola immagine per confermare un corretto acquisizione. Selezionare casualmente una pozzetta trattata con il veicolo e acquisire un'immagine.Se l'immagine è a fuoco e mostra l'espressione di GFP nella testa. Posizionare il cursore sulle aree più luminose e verificare che l'intensità della fluorescenza rientri nell'intervallo della telecamera a 16 bit. Inferiore a 65.000 unità.Ripetere questi passaggi con un altro controllo veicolo e alcune pozzette trattate con il composto. Se necessario, regolare la potenza del laser e il guadagno in modo che le regioni più luminose nelle immagini del controllo positivo non siano saturate. Successivamente, nella finestra di acquisizione della piastra e di controllo, scegliere "acquisisci piastra" per avviare la scansione della piastra.Lo strumento acquisirà automaticamente un'immagine per ogni pozzetto dell'intera micropiastra e le archivierà in un database SQL server. Al termine della scansione, caricare le immagini in D definition's Developer aprendo Developer con l'opzione slinger abilitata.Crea un nuovo spazio di lavoro. Quindi, dal menu file, seleziona l'importazione personalizzata. Successivamente, vai alla cartella contenente le immagini e apri un file di esempio.Scegliere un filtro di importazione che riconosca il formato delle immagini e la struttura dei file generati dalla piattaforma Molecular Devices ImageXpress Ultra. Per elaborare le immagini, aprire un'immagine di controllo e caricare la tecnologia della rete cognitiva desiderata, ovvero l'algoritmo CNT o un insieme di regole. L'algoritmo personalizzato utilizzato in questo caso è stato progettato per identificare automaticamente l'embrione, il tuorlo e la testa e per quantificare luminosità e area delle strutture della testa che esprimono GFP; eseguire quindi l'insieme di regole fino alla fase di rilevamento della testa e del tuorlo.Per garantire un corretto riconoscimento del sacco vitellino e della testa, modificare l'insieme di regole per regolare la soglia di rilevamento del sacco vitellino qualora risulti troppo grande o troppo piccolo. Successivamente, eseguire l'insieme di regole fino alla fase di rilevamento delle strutture luminose della testa. Per assicurare un corretto riconoscimento delle aree esprimenti GFP nella testa, modificare l'insieme di regole per regolare la soglia di rilevamento delle strutture della testa in multipli dell'intensità media fino a quando il rilevamento delle strutture luminose della testa corrisponda all'osservazione visiva.Successivamente, eseguire manualmente l'intero set di regole su diverse immagini scelte casualmente generate da embrioni trattati con veicolo e su immagini di controllo positivo provenienti da embrioni trattati con PCI. Per eseguire l'algoritmo su tutte le immagini della piastra, selezionare le piastre da analizzare e scegliere Analizza, quindi passare al set di regole ottimizzato e analizzare tutti i pozzetti.Utilizzando il pianificatore di lavoro integrato, i pozzetti vuoti o le immagini ambigue verranno automaticamente esclusi dall'analisi durante la scansione. Viene mostrata una mappa di mantenimento in continuo aggiornamento. Sia i dati che le immagini sono accessibili durante l'esecuzione per un controllo visivo.I dati numerici e le immagini elaborate vengono salvati automaticamente. Una volta analizzate tutte le immagini, i dati possono essere esportati in software di terze parti come Excel, GraphPad o Prism. Questa figura mostra immagini di scansione archiviate provenienti da una piastra trattata con veicolo e da una piastra trattata con BCI, con e senza analisi CNT.La proteina verde fluorescente (GFP) applicata viene rilevata nell'occhio, al confine tra mesencefalo e romboencefalo e nei gangli trigeminali di embrioni transgenici. Si noti che sia l'intensità della GFP sia i domini di espressione risultano ampliati. Negli embrioni trattati con BCI, si osserva un effetto dose-dipendente del BCI sull'espressione del gene reporter GFP negli embrioni transgenici.La concentrazione necessaria per ottenere una risposta massima al 50% o EC 50 era di circa 12 micromoli. Vi abbiamo appena mostrato come allevare, raccogliere e disporre embrioni di pesce zebra transgenico in piastre a 96 pozzetti. Abbiamo aggiunto concentrazioni crescenti di PCI nel proprio attivatore della via di segnalazione.Abbiamo inoltre mostrato come automatizzare l'acquisizione di immagini di embrioni transgenici e abbiamo analizzato le immagini con un algoritmo appositamente progettato basato sulla tecnologia di rete cognitiva. Con questo approccio, siamo stati in grado di misurare in modo quantitativo e graduale gli effetti di un attivatore molecolare di piccole dimensioni della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere con attenzione gli embrioni per minimizzare la variabilità tra i campioni.È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.

Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Descriviamo il flusso di lavoro di un sistema di screening e l'analisi dei dati per valutare la tossicità dei composti chimici in base alla risposta di trasalimento dell'embrione di zebrafish. Il sistema registra i movimenti degli embrioni di zebrafish in seguito all'esposizione a uno stimolo vibrazionale e consente una valutazione integrata della tossicità/letalità generale e della tossicità neuromuscolare.

Valutazione della tossicità delle sostanze chimiche utilizzando un sistema di screening della risposta all'allievo delle vibrazioni del pesce zebra

Scopri l'imaging automatizzato e l'analisi chimica per screening su zebrafish. Questo metodo misura gli effetti dose-dipendenti di BCI sulla segnalazione FGF, facilitando screening ad alto rendimento su embrioni transgenici di Danio rerio.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

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