Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.
24 giugno 2010
Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.
In questo video, viene eseguito uno screening ad alto contenuto basato su immagini per valutare la modulazione basata su piccole molecole del fattore di crescita dei fibroblasti: percorso della mappa chinasi Rasm Negli embrioni di pesce zebra, i maschi transgenici e le femmine di pesce zebra di tipo selvatico vengono accoppiati in una gabbia di riproduzione. Le uova fecondate cadono sul fondo e vengono raccolte e trasferite in una capsula di Petri. Gli embrioni vengono incubati durante la notte, quindi posti in pozzetti individuali di una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti.
La piccola molecola BCI viene aggiunta per iperattivare la segnalazione FGF e la piastra viene incubata per sei ore. Le immagini di ciascuna volontà vengono catturate con un lettore di piastre confocali e analizzate utilizzando un algoritmo auto-progettato che riporta le intensità fluorescenti in specifiche strutture embrionali. Ciao, sono Hiba Kado del laboratorio del Dr.Michael Chang presso il Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare dell'Università di Pittsburgh.
Ciao, sono Andrea Spock dell'Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute. Oggi vi mostreremo la procedura per l'allevamento, la selezione e l'organizzazione degli embrioni di pesce zebra per il trattamento chimico. In una piastra a 96 pozzetti, utilizzeremo embrioni transgenici che riportano l'attività del fattore di crescita in fibra di vetro e trattati con una molecola che iperattiva questo passato bianco.
Ti mostreremo come utilizziamo la metodologia di screening ad alto contenuto per acquisire, analizzare e quantificare automaticamente l'attività del fattore di crescita dei fibroblasti negli embrioni di pesce zebra transgenico. Questa procedura evidenzierà la tecnologia della piattaforma per l'utilizzo di pesci zebra transgenici e schermi chimici ad alto rendimento. Quindi iniziamo.
Due giorni prima del trattamento, identificare i pesci zebra transgenici maschi omozigoti e metterli in vasche di accoppiamento individuali. Aggiungi separatori alle vasche, quindi aggiungi un pesce femmina di tipo selvatico a ciascuna vasca e lascia il pesce nelle gabbie di accoppiamento durante la notte a 28 gradi Celsius. La mattina dopo, rimuovere il separatore Dopo un'ora, spostare il pesce in una nuova vasca e versare gli embrioni in un setaccio di plastica.
Trasferire gli embrioni in piastre da 100 millimetri con una soluzione E tre e incubare a 28 gradi Celsius per sei-otto ore. Dopo l'incubazione, esaminare gli embrioni al microscopio stereoscopico. Gli embrioni adatti agli esperimenti saranno sottoposti a gas.
A questo punto, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati, che rimarranno allo stadio di singola cellula. Inoltre, rimuovere gli embrioni non vitali che appaiono opachi o malformati. Quindi aggiungere la soluzione fresca di E tre e incubare per una notte a 28 gradi Celsius.
Il giorno successivo, metti gli embrioni sotto uno stereomicroscopio fluorescente per ordinare gli embrioni transgenici per uno stadio simile e uniforme. Espressione GFP 24 embrioni HPF mostrano un confine visibile nel cervello medio posteriore con un'intensa espressione di GFP e occhi ben formati con retine dorsali GFP positive. Questi embrioni sono attivi e si muoveranno e si dimeneranno nel loro corion usando una pipetta di plastica da pascolo.
Trasferire i 24 embrioni HPF uno alla volta in pozzetti individuali di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere l'eventuale eccesso di soluzione di E tre dai pozzetti. Quindi, utilizzando un pipettatore multicanale, aggiungere 200 microlitri di soluzione E tre a ciascun pozzetto.
Quindi, aggiungere due microlitri di DMSO a tutti i pozzetti nelle colonne uno e 12. Quindi aggiungere due microlitri di BCL preparato in DMSO come segue, uno, micromolare alle colonne due e sette. Cinque micromolari a tre e otto, 10 micromolari a quattro e nove 20.
Micromolare alle colonne cinque e 10. E infine 25 micromolari alla colonna sei e 11. Ora copri la piastra con un foglio di alluminio e incubala per sei ore a 28 gradi Celsius.
Aggiungere 10 microlitri di trica in ogni pozzetto per anestetizzare i 30 embrioni HPF. Quindi caricare la piastra nei dispositivi molecolari image express ultra open meta express software. Scegli una configurazione con un obiettivo Forex e un diametro massimo del foro stenopeico.
Configura la messa a fuoco automatica del laser per rilevare il fondo della lastra e utilizzare un offset Z ottimale predeterminato. Per rilevare le regioni di interesse, impostare l'area di scansione come un singolo sito di 2000 x 2000 pixel senza benning. Selezionare il tipo di piastra appropriato e il laser ad argon da 488 nanometri all'eccitazione su lunghezze d'onda di emissione di 488 su 525 nanometri.
Quindi selezionare un pozzetto contenente un embrione trattato con veicolo e fare clic su Trova campione. Lo strumento eseguirà una scansione con messa a fuoco automatica e acquisirà una singola immagine per confermare la corretta acquisizione dell'immagine. Seleziona casualmente un veicolo trattato bene e acquisisci un'immagine.
Se l'immagine è a fuoco e mostra l'espressione GFP nella testa. Posizionare il cursore sulle aree più luminose e verificare che l'intensità della fluorescenza rientri nell'intervallo della fotocamera a 16 bit. Meno di 65.000 unità.
Ripetere questi passaggi con un altro controllo del veicolo e alcuni pozzetti trattati con composto. Se necessario, regolare la potenza e il guadagno del laser in modo tale che le regioni più luminose nelle immagini di controllo positivo non si saturino. Successivamente, nella finestra di acquisizione e controllo delle lastre, scegliere Acquisisci lastra per avviare la scansione delle lastre.
Lo strumento acquisirà automaticamente un'immagine per pozzetto per l'intera micropiastra e le archivierà in un database SQL Server. Una volta terminata la scansione, carica le immagini in D definition. Sviluppatore aprendo sviluppatore con l'opzione fionda abilitata.
Creare una nuova area di lavoro. Quindi, dal menu File, seleziona l'importazione personalizzata. Quindi, vai alla cartella contenente le immagini e apri un file di esempio.
Scegli un filtro di importazione che riconosca il formato dell'immagine e la struttura dei file generati dalla piattaforma Image Express Ultra dei dispositivi molecolari. Ora per elaborare le immagini, apri un'immagine di controllo e carica la tecnologia di rete cognitiva desiderata o l'algoritmo CNT o il set di regole. L'algoritmo personalizzato utilizzato qui è progettato per identificare automaticamente l'embrione, il tuorlo e la testa e per quantificare la luminosità e l'area delle strutture della testa che esprimono GFP, eseguire la regola impostata sulla fase di rilevamento della testa e del tuorlo.
Per garantire la corretta assegnazione del sacco vitellino e della testa, modificare il set di regole per regolare la soglia di rilevamento del tuorlo se il tuorlo è troppo grande o troppo piccolo. Quindi, esegui il set di regole per la fase di rilevamento delle strutture della testa luminosa. Per garantire la corretta assegnazione delle aree che esprimono GFP nella testa, modificare il set di regole per regolare la soglia di rilevamento delle strutture della testa come multipli dell'intensità umile fino a quando il rilevamento delle strutture luminose della testa non corrisponde all'osservazione visiva.
Successivamente, esegui manualmente l'intero set di regole su diverse immagini scelte casualmente generate da embrioni trattati con veicolo e immagini di controllo positivo da embrioni trattati con PCI. Per eseguire l'algoritmo su tutte le immagini delle lastre, selezionare le lastre da analizzare e scegliere. Analizza, quindi passa al set di regole ottimizzato e analizza tutti i pozzetti.
Utilizzando il pianificatore di lavori integrato, i pozzetti vuoti o le immagini ambigue verranno automaticamente esclusi dall'analisi durante la scansione. Viene visualizzata una mappa di mantenimento in continuo aggiornamento. Sia i dati che le immagini sono accessibili durante la corsa per l'ispezione visiva.
I dati numerici e le immagini elaborate vengono salvati automaticamente. Dopo che tutte le immagini sono state analizzate, i dati possono essere esportati in software di terze parti come Excel, GraphPad o prism. Questa figura mostra le immagini di scansione archiviate da un veicolo trattato e da un BCI trattato bene con e senza analisi CNT.
La proteina fluorescente verde applicata o GFP viene rilevata nell'occhio, nel limite cerebrale posteriore medio e nei gangli del trigemino di embrioni transgenici. Si noti che sia l'intensità della GFP che i domini di espressione sono espansi. Negli embrioni trattati con BCI, si osserva un effetto dose-dipendente dell'ICB sull'espressione del gene reporter GFP negli embrioni transgenici.
La concentrazione richiesta per suscitare una risposta semimassimale o EC 50 era di circa 12 micromolari. Vi abbiamo appena mostrato come allevare, raccogliere e organizzare embrioni di pesce zebra transgenico in piastre a 96 pozzetti. Abbiamo aggiunto una crescente concentrazione di PCI nel proprio attivatore della via di segnalazione.
Abbiamo anche mostrato come automatizzare l'imaging di embrioni transgenici e abbiamo analizzato le immagini con un algoritmo progettato su misura basato sulla tecnologia della rete cognitiva. Con questo approccio, siamo stati in grado di misurare quantitativamente in modo graduato gli effetti di una piccola molecola attivatrice della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere attentamente gli embrioni per ridurre al minimo la variabilità tra i campioni.
Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo studio presenta un sistema per l'acquisizione e l'analisi automatizzate di embrioni di pesce zebra transgenici in piastre multipozzetto. Illustra la capacità di misurare gli effetti dipendenti dalla dose della molecola di piccole dimensioni BCI sull'espressione del gene reporter del Fattore di Crescita dei Fibroblasti, facilitando schermate chimiche ad alto rendimento su pesce zebra.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Screening ad alto rendimento
Sfondo
- Il pesce zebra è comunemente utilizzato come organismo modello nella biologia dello sviluppo.
- I pesci zebra transgenici possono esprimere proteine fluorescenti, consentendo la visualizzazione dell'espressione genica.
- Il screening ad alto contenuto consente l'analisi simultanea di più campioni.
- La segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) è fondamentale per diversi processi dello sviluppo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di imaging ad alto rendimento per embrioni di pesce zebra.
- Valutare gli effetti di piccole molecole sulla segnalazione FGF.
- Automatizzare l'analisi dell'espressione genica in pesci zebra transgenici.
Metodi Utilizzati
- Allevamento di zebrafish transgenici e raccolta di embrioni.
- Incubazione degli embrioni in piastre multipozzetto con concentrazioni variabili di BCI.
- Acquisizione automatica delle immagini mediante un lettore di piastre confocale.
- Analisi delle intensità fluorescenti mediante un algoritmo personalizzato.
Risultati principali
- Imaging e analisi riusciti di embrioni di pesce zebra in formato ad alta produttività.
- Effetti dose-dipendenti dimostrati del BCI sul segnale FGF.
- L'analisi automatizzata ha fornito una quantificazione affidabile dell'espressione genica.
- È stata stabilita una piattaforma per futuri screening chimici nel pesce zebra.
Conclusioni
- Il sistema sviluppato aumenta l'efficienza degli screening chimici nei zebrafish.
- Fornisce uno strumento utile per lo studio della segnalazione FGF nello sviluppo.
- Questa metodologia può essere applicata ad altre molecole piccole e vie di segnalazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi automatizzata mediante imaging degli embrioni di pesce zebra consente una valutazione scalabile e in vivo della modulazione delle vie di segnalazione, supportando la validazione precoce dei bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nei processi di scoperta. L'approccio fornisce letture quantitative e dipendenti dalla dose che migliorano l'affidabilità predittiva degli effetti dei composti sull'attività della via FGF/RAS/MAPK. Ciò colloca il metodo come ponte traslazionale tra lo screening fenotipico e l'identificazione di composti promettenti nella ricerca e sviluppo del settore biotecnologico e farmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la modulazione della segnalazione FGF in un sistema vertebrale rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico attraverso la quantificazione automatizzata dell'espressione del reporter GFP nelle strutture cefaliche embrionali.
- Valore predittivo: Genera dati di EC50 (circa 12 micromolare per BCI) per definire le relazioni struttura-attività e guidare la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce letture standardizzate e riproducibili di intensità fluorescente da formati a piastre 96 pozzetti compatibili con flussi di lavoro ad alto rendimento.
- Scalabilità: Consente il posizionamento in matrice di embrioni transgenici a 24 hpf per il trattamento con composti e l'acquisizione automatica di immagini mediante lettori confocali HCS.
- Utilità dell'algoritmo: L'algoritmo personalizzato di Cognition Network Technology rileva e quantifica l'espressione di GFP in regioni embrionali definite, permettendo una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza embrioni di pesce zebra a 24-48 hpf, uno stadio di sviluppo con organi formati e trasparenza tissutale, che favorisce l'estrapolazione da in vivo a preclinico.
- De-risking meccanicistico: Misura risposte specifiche del percorso (attivazione del FGF) per distinguere gli effetti del composto sul bersaglio da quelli fuori bersaglio.
- Allineamento del biomarcatore: L'espressione del reporter GFP funge da biomarcatore traslazionale per la modulazione della via del FGF, rilevabile mediante analisi automatizzata delle immagini.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del bersaglio e consentendo lo sviluppo di saggi scalabili per campagne di identificazione di composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi e la definizione della fiducia nel bersaglio attraverso l'analisi dose-risposta della modulazione della segnalazione FGF.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante acquisizione e analisi automatizzata delle immagini, assicurando riproducibilità tra diverse concentrazioni del composto.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (intensità e area della GFP) che permettono il confronto tra potenza ed efficacia dei composti.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando embrioni di vertebrati con percorsi di segnalazione conservati e organogenesi visibile.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di molteplici piccole molecole e percorsi di segnalazione mediante reporter transgenici intercambiabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella modulazione del bersaglio e riduce l'ambiguità meccanicistica nei test in fase iniziale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie all'acquisizione di immagini automatizzata e all'analisi basata su algoritmi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati quantitativi e dipendenti dalla dose sull'attività della via di segnalazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei composti aggiustata in base al rischio, basata su parametri quali la CE50 e la risposta massimale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, nella manipolazione di embrioni transgenici e nella microscopia a fluorescenza.
- È dipendente da strumentazione per screening ad alto contenuto confocale (ad esempio, Molecular Devices ImageXpress Ultra) e software per l'analisi delle immagini (Definiens Developer).
- Necessita di standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per lo stadio degli embrioni, la preparazione dei composti e i parametri di acquisizione delle immagini.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica l'algoritmo a diversi reporter transgenici o strutture embrionali.
- I limiti pratici includono la variabilità degli embrioni e la necessità di una selezione accurata dei campioni per ridurre al minimo il rumore, come indicato nel protocollo.
