L'utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull'espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'elettroporazione per introdurre siRNA in cellule difficili da trasfettare al fine di studiare l'espressione genica. Ciò si ottiene determinando prima la quantità di sospensione delle celle awa necessaria utilizzando il TC 10. Il contatore automatico di celle irna viene quindi aggiunto alla sospensione cellulare e le celle vengono create per elettro.

Utilizzando il sistema di elettroporazione MXL, le celle vengono incubate per 24 ore dopo l'elettroporazione. Quindi viene aggiunto IL 4 per indurre la trascrizione genica nelle cellule sperimentali. Infine, l'RNA viene estratto e la PCR in tempo reale viene utilizzata per misurare i livelli di espressione genica.

In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'effetto di specifici siRNA sulle vie di espressione genica. Ciao, sono Adam McCoy, scienziato senior per la divisione di espressione genica di Bio Rad Laboratories. Oggi vi mostreremo la procedura per l'introduzione di RNA in linee cellulari difficili da trasfettare mediante elettroporazione e poi esamineremo gli effetti sull'espressione genica.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per analizzare l'espressione genica di singoli geni o studiare i percorsi genici eliminando un gene e cercando effetti a valle. Quindi iniziamo. Lavorando sotto una cappa di coltura cellulare, rimuovere le cellule da un pallone di coltura.

Le cellule utilizzate in questo protocollo sono cellule in sospensione. Se stai utilizzando una cellula aderente, dovrai tripsina gli occhi prima di rimuoverli. Centrifugare le celle per pellettizzarle.

Dopo che le cellule sono state centrifugate, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in PBS. Per determinare il numero di cellule vive, prendere un'aliquota della sospensione cellulare e aggiungere la colorazione blu trian in un rapporto di uno a uno per colorare le cellule morte. Il blu Trian è necessario per la valutazione delle cellule morte vive, ma non per la conta totale delle cellule.

Versare la miscela solo sull'apertura di un vetrino di conteggio monouso e inserirla nel contacellule automatizzato TC 10. Il TC 10 prima metterà a fuoco automaticamente per garantire il conteggio più accurato e poi inizieremo a contare le celle. Viene visualizzato il numero di cellule vive e totali per millilitro nel campione.

Selezionare Visualizza immagine per visualizzare le celle nella schermata di visualizzazione. Quindi utilizzando le frecce su o giù. Ingrandire o ridurre in base alle esigenze per calcolare la quantità di sospensione cellulare necessaria per gli esperimenti, selezionare il calcolatore di diluizione.

Inserire i valori di concentrazione e volume finale desiderati per questo esperimento. Verranno preparati 16 campioni totali, inclusi i duplicati per ogni trattamento. Quindi saranno necessari un totale di 3,6 millilitri di una sospensione cinque volte 10 delle sei celle per millilitro.

Il contatore di cellule riporterà quindi il volume di sospensione cellulare necessario in base alla conta delle cellule vive e ai valori target inseriti. Se è stato utilizzato TRIAM blue, il contatore si regolerà automaticamente per la diluizione uno a uno utilizzata. Ora sotto un cofano, trasferire il volume calcolato della sospensione cellulare in un nuovo tubo.

Quindi far girare le miscele di celle per pellettare le cellule mentre le cellule stanno girando verso il basso. Preparare i tubi micro fuge per l'elettroporazione aggiungendo SIR A a ciascun tubo. Per questo esperimento, verranno preparati un irna di controllo, due siRNA specifici e controlli non resecati Dopo la centrifugazione, rimuovere il PBS e risospendere le cellule in 3,6 millilitri di tampone di elettroporazione del gene Pulser, trasferire 800 aliquote di microlitri in provette contenenti l'IRNA appropriato e mescolare delicatamente.

Le celle sono ora pronte per l'elettroporazione per mangiare tutti i campioni contemporaneamente. Utilizzando il sistema di elettroporazione MXL, trasferire 150 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti appropriati di una piastra di elettroporazione a 96 pozzetti. Quindi, inserire la piastra nella camera della piastra del sistema di elettroporazione MXL e chiudere il coperchio.

Selezionare il protocollo di elettroporazione desiderato e premere l'impulso per mangiare le cellule al termine dell'elettroporazione, rimuovere la piastra dallo strumento e trasferire le cellule in una nuova piastra di coltura tissutale contenente il preriscaldamento al terreno. Quindi, trasferire 150 microlitri di celle di controllo non classificate per ogni campione nella nuova piastra. Quindi posizionare le celle a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte.

Dopo 24 ore, utilizzare IL 4 per indurre la trascrizione genica in un set di cellule e aggiungere il terreno solo al secondo set. Un IL quattro viene aggiunto alle celle. Incubare altre 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica dopo un totale di 48 ore di crescita.

Ci possono essere grandi differenze nella densità cellulare se il trattamento sperimentale influisce sulla divisione cellulare. È quindi consigliabile utilizzare il contatore automatico di cellule TC 10 per contare rapidamente le cellule in base alla conta delle cellule. Trasferire un'aliquota da ciascun pozzetto in una provetta per microfumo per l'estrazione e il congelamento dell'RNA.

Una seconda aliquota per il western blotting o altre analisi proteiche. Oggi verrà mostrato solo il flusso di lavoro dell'RNA. Centrifugare i campioni per pellettare le cellule.

Quindi rimuovere ed eliminare il natina SUP da ciascun tubo. Procedere con l'estrazione dell'RNA utilizzando il kit di RNA totale orum. Una volta estratto l'RNA, procedere immediatamente con l'analisi, mantenendo i campioni in ghiaccio.

Per verificare la qualità e la quantità dell'RNA in un'unica fase, utilizzare la stazione di elettroforesi automatizzata Experian, denaturare a caldo i campioni e la scala di RNA Experian e posizionarli sul ghiaccio. Aggiungi una miscela preparata di gel e macchia all'adescamento. Bene, su un chip RNA, imposta il codice di priming sulla stazione di priming.

Posizionare il truciolo nella stazione di adescamento automatizzata e premere start. Rimuovere il truciolo dalla stazione di adescamento e caricarlo. Vorticare il chip per mescolare i campioni con il tampone di caricamento.

Posizionare il chip nella stazione di elettroforesi e iniziare la corsa. Il software Experian visualizzerà automaticamente i risultati sotto forma di elettroferogramma, una tabella dei risultati che mostra la concentrazione di RNA, il rapporto ribosomiale, il numero dell'indicatore di qualità dell'RNA e un gel virtuale, che sembra simile a un tradizionale gel di RNA. I campioni di RNA totale di alta qualità avranno in genere un RQI da 8 a 10.

Dopo aver verificato la qualità dell'RNA, preparare qui le reazioni del CD NA. Lo script IS ONEstep R-T-P-C-R mix viene utilizzato per combinare la sintesi CD NA e la PCR in tempo reale. In una reazione, creare una miscela master contenente tutti i componenti della reazione tranne i modelli di RNA per ciascun set di primer.

Quindi distribuire la miscela nei pozzetti di una piastra PCR. Dopo aver diluito l'RNA a una concentrazione uniforme, aggiungere i campioni nei pozzetti appropriati e triplicare. Sigillare la piastra, inserirla nella macchina per PCR in tempo reale, quindi selezionare il protocollo appropriato e iniziare la corsa una volta completata la corsa, utilizzare le tracce in tempo reale per determinare i livelli di espressione.

Il software calcola l'espressione genica normalizzata dai dati in base all'espressione relativa di geni sperimentali e di riferimento in cellule trattate e controllate. Questa figura mostra una panoramica del legame della via di segnalazione IL 4 di IL 4 al suo recettore. Porta alla diarizzazione e all'attivazione di STAT sei, STAT sei attivato trasloca nel nucleo e attiva la trascrizione del suo bersaglio.

Geni come CCL 17 senza trascrizione di induzione IL four di CCL 17 rimarranno a bassi livelli costitutivi dopo il silenziamento mediato da irna del gene STAT six. Il trattamento con IL 4 dovrebbe portare a un aumento minimo o nullo dell'espressione di CCL 17. L'induzione di CCL 17 da parte di IL 4 è stata misurata in diverse condizioni mediante tempo reale quantitativo.

I campioni di PCR cresciuti senza IL 4 avevano un basso livello costitutivo di espressione. Indipendentemente dal sir, l'A somministrato come mostrato nei campioni di controllo verde e blu ha risposto normalmente al trattamento con IL 4 con un'induzione da otto a dieci volte di CCL 17. Tuttavia, le cellule trasfettate con siRNA che hanno come bersaglio STAT 6 mostrate in rosso e rosa avevano diminuito l'espressione di CCL L 17 in risposta a IL quattro, supportando l'idea che STAT sei svolga un ruolo nell'espressione indotta da IL quattro di CCL 17.

Vi abbiamo appena mostrato come inserire i siRNA in una linea cellulare in sospensione difficile da trasfettare e come seguire l'espressione di un gene in quelle cellule. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cose il più coerenti possibile in tutti i campioni. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.