L'utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull'espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa
14 aprile 2010
Questa procedura descrive un flusso di lavoro rapido e facile per introdurre siRNA difficile trasfezione in linee cellulari e seguire l'espressione genica mediante real-time PCR. L'utilizzo di un contatore di cellule automatizzati, multi-pozzetti elettroporazione, e la stazione di elettroforesi automatizzata fornire risultati rapidi e affidabili, senza bisogno di costosi movimentazione robotica.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'elettroporazione per introdurre siRNA in cellule difficili da trasfettare al fine di studiare l'espressione genica. Questo viene ottenuto innanzitutto determinando la quantità di sospensione cellulare necessaria mediante il contatore cellulare automatico TC 10. Successivamente, l'irna viene aggiunto alla sospensione cellulare e le cellule vengono elettroporate.
Utilizzando il sistema di elettroporazione MXL, le cellule vengono incubate per 24 ore dopo l'elettroporazione. Successivamente, l'IL-4 viene aggiunta per indurre la trascrizione genica nelle cellule sperimentali. Infine, l'RNA viene estratto e la PCR in tempo reale viene utilizzata per misurare i livelli di espressione genica.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'effetto di specifici siRNA sui percorsi di espressione genica. Ciao, sono Adam McCoy, scienziato senior della divisione di espressione genica di Bio Rad Laboratories. Oggi vi mostreremo la procedura per introdurre RNA in linee cellulari difficili da trasfettare mediante elettroporazione e successivamente analizzeremo gli effetti sull'espressione genica.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per analizzare l'espressione genica di singoli geni o studiare percorsi genici eliminando un gene e cercando effetti a valle. Cominciamo dunque. Lavorando sotto una cappa da colture cellulari, rimuovere le cellule da un'ampolla di coltura.
Le cellule utilizzate in questo protocollo sono cellule in sospensione. Se si utilizzano cellule aderenti, sarà necessario trattarle con tripsina prima di rimuoverle. Centrifugare le cellule per formare il pellet.
Dopo aver centrifugato le cellule, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in PBS. Per determinare il numero di cellule vitali, prelevare un'aliquote della sospensione cellulare e aggiungere il colorante trian blue in rapporto uno a uno per colorare le cellule morte. Il trian blue è necessario per la valutazione delle cellule vive e morte, ma non per il conteggio totale delle cellule.
Applicare soltanto una goccia della miscela sull'apertura di un vetrino monouso per conta cellulare e inserirlo nel contatore cellulare automatico TC 10. Il TC 10 eseguirà innanzitutto la messa a fuoco automatica per garantire una conta il più accurata possibile, quindi inizierà a contare le cellule. Sul display verranno mostrati il numero di cellule vitali e il numero totale di cellule per millilitro nel campione.
Selezionare "Visualizza immagine" per mostrare le cellule sullo schermo di visualizzazione. Quindi, utilizzando le frecce su o giù, ingrandire o ridurre l'immagine secondo necessità per calcolare la quantità di sospensione cellulare necessaria per gli esperimenti; selezionare il calcolatore di diluizione.
Inserire la concentrazione desiderata e i valori del volume finale per questo esperimento. Verranno preparati in totale 16 campioni, inclusi i duplicati per ogni trattamento. Saranno quindi necessari 3,6 millilitri di una sospensione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro.
Il contatore di cellule indicherà quindi il volume di sospensione cellulare necessario in base al numero di cellule vitali e ai valori obiettivo inseriti. Se è stato utilizzato il blu TRIAM, il contatore effettuerà automaticamente la correzione per la diluizione uno a uno utilizzata. Ora, sotto cappa, trasferire il volume calcolato di sospensione cellulare in un nuovo tubo.
Quindi centrifugare le miscele cellulari per formare il pellet cellulare mentre le cellule sedimentano. Preparare le provette microcentrifuga per l'elettroporazione aggiungendo SIR A in ciascuna provetta. Per questo esperimento, si prepareranno un controllo irna, due stat sei siRNA specifici e controlli non trattati. Al termine della centrifugazione, rimuovere il PBS e risospendere le cellule in 3,6 millilitri di buffer per elettroporazione Gene Pulser; trasferire aliquote di 800 microlitri nelle provette contenenti l'IRNA appropriato e mescolare delicatamente.
Le cellule sono ora pronte per l'elettroporazione, che consente di trattare tutti i campioni contemporaneamente. Utilizzando il sistema di elettroporazione MXL, trasferire 150 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti corrispondenti di una piastra di elettroporazione a 96 pozzetti. Successivamente, inserire la piastra nella camera della piastra del sistema di elettroporazione MXL e chiudere il coperchio.
Selezionare il protocollo di elettroporazione desiderato e premere il pulsante per l'impulso; al termine dell'elettroporazione, rimuovere la piastra dall'apparecchio e trasferire le cellule in una nuova piastra per colture cellulari contenente mezzo preriscaldato. Successivamente, trasferire 150 microlitri di cellule di controllo non trattate per ogni campione nella nuova piastra. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte.
Dopo 24 ore, utilizzare l'IL-4 per indurre la trascrizione genica in un insieme di cellule e aggiungere solo mezzo all'altro insieme. Un IL-4 viene aggiunto alle cellule. Incubare ulteriori 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, per un totale di 48 ore di crescita.
Possono verificarsi grandi differenze nella densità cellulare se il trattamento sperimentale influisce sulla divisione cellulare. Pertanto, è consigliabile utilizzare il contatore cellulare automatico TC 10 per contare nuovamente rapidamente le cellule in base ai conteggi cellulari. Trasferire un'aliquote da ogni pozzetto in una provetta microcentrifuga per l'estrazione dell'RNA e congelare.
Un secondo aliquota per il western blot o altre analisi proteiche. Oggi verrà mostrato solo il flusso di lavoro per l'RNA. Centrifugare i campioni per formare un pellet cellulare.
Quindi rimuovere e scartare il SUP natin da ogni provetta. Procedere con l'estrazione dell'RNA utilizzando il kit per RNA totale orum. Una volta estratto l'RNA, procedere immediatamente con l'analisi, mantenendo i campioni sul ghiaccio.
Per verificare in un unico passaggio la qualità e la quantità dell'RNA, utilizzare la stazione di elettroforesi automatizzata Experian per denaturare i campioni a caldo e l'indicatore RNA Experian, quindi posizionare il tutto sul ghiaccio. Aggiungere una miscela preparata di gel e colorante alla pozzetta di condizionamento su un chip RNA, impostando il codice di condizionamento sulla stazione di condizionamento.
Posizionare il chip nella stazione di prime automatica e premere start. Rimuovere il chip dalla stazione di prime e caricare il chip. Vortexare il chip per mescolare i campioni con il buffer di caricamento.
Posizionare il chip nella stazione di elettroforesi e avviare la corsa. Il software Experian visualizzerà automaticamente i risultati sotto forma di un elettroferogramma, una tabella dei risultati che mostra la concentrazione dell'RNA, il rapporto ribosomiale e il numero indicatore della qualità dell'RNA, e un gel virtuale, simile a un gel di RNA tradizionale. Campioni di RNA totale di alta qualità avranno tipicamente un RQI compreso tra otto e dieci.
Dopo aver verificato la qualità dell'RNA, preparare qui le reazioni di CD NA. La miscela IS script ONEstep R-T-P-C-R viene utilizzata per combinare la sintesi di CD NA e la PCR in tempo reale. In una singola reazione, preparare una miscela master contenente tutti i componenti della reazione, esclusi i templati di RNA, per ogni set di primer.
Quindi distribuire la miscela nei pozzetti di una piastra per PCR. Dopo aver diluito l'RNA a una concentrazione uniforme, aggiungere i campioni nei pozzetti appropriati in triplicato. Sigillare la piastra, inserirla nel termociclatore in tempo reale, selezionare il protocollo appropriato e avviare la corsa. Al termine della corsa, utilizzare i tracciati in tempo reale per determinare i livelli di espressione.
Il software calcola l'espressione genica normalizzata dai dati in base all'espressione relativa dei geni sperimentali e di riferimento in cellule trattate e controllate. Questa figura mostra una panoramica della via di segnalazione di IL-4, in cui il legame di IL-4 al suo recettore induce la dimerizzazione e l'attivazione di STAT6; STAT6 attivato si trasloca nel nucleo e attiva la trascrizione dei suoi geni bersaglio.
Geni come CCL 17 senza induzione da parte di IL-4, la trascrizione di CCL 17 rimarrà a livelli costitutivi bassi dopo il silenziamento mediato da RNA del gene STAT6. Il trattamento con IL-4 dovrebbe portare a un aumento minimo o nullo dell'espressione di CCL 17. L'induzione di CCL 17 da parte di IL-4 è stata misurata in diverse condizioni mediante PCR quantitativa in tempo reale.
I campioni di PCR coltivati senza IL-4 hanno mostrato un basso livello costitutivo di espressione. Indipendentemente dal sir, A somministrato come mostrato nei campioni di controllo verde e blu ha risposto normalmente al trattamento con IL-4, con un'induzione da otto a dieci volte maggiore di CCL17. Tuttavia, le cellule trasfettate con siRNA mirati a STAT6, mostrati in rosso e rosa, hanno presentato una ridotta espressione di CCL17 in risposta a IL-4, sostenendo l'ipotesi che STAT6 svolga un ruolo nell'espressione indotta da IL-4 di CCL17.
Abbiamo appena mostrato come trasfettare siRNA in una linea cellulare in sospensione difficile da trasfettare e come seguire l'espressione genica in queste cellule. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le condizioni il più possibile costanti in tutti i campioni. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questa procedura descrive un flusso di lavoro per l'introduzione di siRNA in linee cellulari difficili da trasfettare e l'analisi dell'espressione genica mediante PCR in tempo reale. L'uso di sistemi automatizzati migliora l'efficienza e l'accuratezza del processo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Espressione genica
- Tecniche di elettroporazione
Sfondo
- L'elettroporazione è un metodo utilizzato per introdurre acidi nucleici nelle cellule.
- Le linee cellulari difficili da trasfettare rappresentano una sfida negli studi sull'espressione genica.
- La PCR in tempo reale è un metodo affidabile per quantificare l'espressione genica.
- I sistemi automatizzati possono semplificare il flusso di lavoro e migliorare i risultati.
Scopo dello studio
- Introdurre siRNA in linee cellulari difficili da trasfettare.
- Valutare l'impatto degli siRNA sui percorsi di espressione genica.
- Utilizzare tecniche automatizzate per aumentare l'efficienza.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della sospensione cellulare e conteggio mediante contatore cellulare automatico.
- Elettroporazione delle cellule con siRNA utilizzando il sistema di elettroporazione MXL.
- Induzione della trascrizione genica con IL-4.
- Estrazione dell'RNA seguita da analisi mediante PCR in tempo reale.
Risultati principali
- Introduzione con successo di siRNA in linee cellulari difficili.
- Misurazione quantitativa dei livelli di espressione genica.
- Dimostrazione degli effetti di specifici siRNA sui percorsi genici.
- Campioni di RNA di alta qualità adatti per applicazioni successive.
Conclusioni
- La procedura facilita efficacemente l'introduzione di siRNA e l'analisi dell'espressione genica.
- I sistemi automatizzati migliorano l'affidabilità dei risultati.
- Questo metodo può essere applicato a diversi contesti di ricerca che coinvolgono l'espressione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo flusso di lavoro consente una consegna efficiente dell'siRNA in cellule in sospensione difficili da trasfettare, supportando la validazione del bersaglio negli studi sull'espressione genica. Il conteggio automatico delle cellule e l'elettroporazione migliorano la riproducibilità e la capacità analitica nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta. L'approccio facilita la riduzione del rischio meccanicistico delle vie di segnalazione come la via IL-4/STAT6 nei modelli di oncologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di regolatori trascrizionali come STAT6 nelle vie di segnalazione dei citochine.
- Valore operativo: Utilizza il conteggio cellulare automatizzato per standardizzare le concentrazioni in ingresso e ottenere un'efficienza di trasfezione costante.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio del bersaglio collegando il silenziamento mediato da siRNA a modifiche nell'espressione genica a valle.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative dell'espressione genica mediante PCR in tempo reale per l'analisi dei percorsi metabolici.
- Valore operativo: Integra l'elettroforesi automatizzata per la valutazione rapida della qualità e quantità dell'RNA.
- Scalabilità: Il sistema di elettroporazione MXL consente l'elaborazione simultanea di più campioni in formato a 96 pozzetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Utilizza cellule Namalwa, un modello di linfoma di Burkitt, per studiare l'espressione genica dipendente da IL-4 rilevante per l'immuno-oncologia.
- Approfondimento meccanicistico: Dimostra il ruolo di STAT6 nell'induzione di CCL17, supportando la validazione del percorso associato a biomarcatori.
- Continuità preclinica: La verifica della qualità dell'RNA consente applicazioni downstream affidabili, inclusa l'analisi proteica e saggi funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo una modulazione e una quantificazione affidabili dei geni.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante silenziamento mediato da siRNA di nodi di segnalazione nel percorso dell'IL-4.
- Screening: Permette la valutazione riproducibile di composti o perturbazioni genetiche attraverso una preparazione standardizzata delle cellule.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi e normalizzati sull'espressione genica per confrontare condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a sistemi rilevanti per le malattie utilizzando modelli cellulari di linfoma.
- Riutilizzo aziendale: Piattaforme automatizzate (TC10, MXL, Experion) riutilizzabili in protocolli con siRNA, CRISPR e trasfezione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi delle vie di segnalazione mediante perturbazione genetica specifica.
- Valore operativo: L'automazione riduce al minimo la variabilità introdotta dall'operatore nel conteggio cellulare, nell'elettroporazione e nel controllo della qualità dell'RNA.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o abbandono del progetto aumentando la fiducia nelle relazioni tra bersaglio e via di segnalazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli in base alla validazione funzionale in modelli pertinenti alla malattia, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nell'elettroporazione e nella manipolazione degli acidi nucleici.
- Presuppone l'accesso a un contatore cellulare automatico, a un sistema di elettroporazione e a una stazione per elettroforesi.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di estrazione dell'RNA e di controllo della qualità tra diversi gruppi di lavoro.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono le diverse efficienze di trasfezione nei tipi cellulari aderenti e in sospensione.
- Limite pratico: potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione dell'elettroporazione per linee cellulari primarie o sensibili.
