Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare grandi complessi proteici mediante spettrometria di massa strutturale. Questo viene ottenuto preparando capillari placcati in oro per l'elettrospruzzo nano-flow. Come secondo passaggio, il campione viene preparato e lo spettrometro di massa viene calibrato per misurazioni ad alta massa.

In seguito, le condizioni sperimentali vengono ottimizzate per mantenere intatti i complessi proteici nella fase gassosa. Vengono quindi acquisite le spettrometrie di massa (MS) e le spettrometrie tandem MS. Gli spettri MS hanno mostrato stati di carica corrispondenti in massa al complesso integro, mentre gli esperimenti di MS tandem hanno fornito il profilo di associazione dei monomeri e dei complessi depurati.

Ciao, sono Naam Kiba del Laboratorio di Miron presso l'Istituto di Scienze Whiteman, e io sono Isaac Ky. Anch'io provengo dal laboratorio di Michelon. Oggi vorremmo mostrarvi la procedura di base per analizzare complessi proteici di grandi dimensioni applicando la spettrometria strutturale, e utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per caratterizzare complessi proteici al fine di definirne la geometria stocastica, la composizione e le reti di interazione. Cominciamo dunque.

L'analisi di complessi proteici non correnti viene eseguita mediante la tecnica di immunizzazione a spruzzo aereo, utilizzando capillari emme plus o a qua. Questo capillare C può essere tirato fino a ottenere una punta fine di circa un micron di diametro e successivamente rivestito con un materiale conduttivo come l'oro. Questi capillari sono disponibili in commercio, come si può vedere qui.

Tuttavia, è molto più conveniente da utilizzare. Le capillari di vetro, ehm, che possono essere raffreddate e rivestite fino allo stato pronto all'uso, vengono sottoposte a raffreddamento su questo dispositivo di raccolta degli aghi e rivestimento su questo dispositivo di rivestimento, ehm. Per iniziare questa procedura, applicare due strisce di un tappetino adesivo bifacciale sul fondo di una piastra di Petri, mantenendo le strisce distanti due centimetri l'una dall'altra.

Posizionare una bacchetta di vetro al centro di uno dei cuscinetti. Il cuscinetto adesivo tiene ferme le capillari e la bacchetta di vetro sostiene le capillari preparate, impedendo che le punte si rompano. Utilizzare capillari in vetro borosilicato Boris con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,78 millimetri.

Inserire un capillare nell'ago, posizionarlo delicatamente e regolarne la posizione in modo che si trovi al centro del filamento riscaldante. Stringere delicatamente le pinze fino a quando i capillari risultano saldamente fissati alle due estremità. Tirare il capillare utilizzando il programma predefinito mostrato qui.

Tuttavia, ricordare che il processo di programmazione della macchina per la trazione è basato su tentativi ed errori. Fino a quando non si ottiene una forma della punta accettabile, ogni capillare tirato produce due capillari finali con la forma desiderata. Rimuovere i capillari tirati dall'apparecchio ed esaminarne le punte, scartando quelli deformi o rotti.

Utilizzare pinzette posizionatrici smussate per posizionare i capillari nella piastra di Petri. La base dei capillari è attaccata al cuscinetto adesivo e la parte superiore poggia sulla bacchetta di vetro con la punta rivolta verso l'alto. Continuare a posizionare i capillari fino a quando la piastra di Petri non sarà piena.

Circa 80 capillari entrano in una piastra di 10 centimetri di diametro. Successivamente, rivestire i capillari con oro. Inserire la piastra nel rivestitore a sputtering d'oro.

Assicurarsi che l'alimentazione del gas sia scelta secondo le istruzioni del produttore e attivare un ciclo di rivestimento predefinito. Il rivestimento viene ripetuto da tre a sei volte fino a quando i capillari non assumono un colore dorato uniforme. Una volta che i capillari sono pronti, procedere con la calibrazione dello spettrometro di massa.

La maggior parte degli esperimenti condotti sui complessi MultiPro viene eseguita mediante uno spettrometro di massa a quadrupolo con elettrospray e tempo di volo, come questo. Inupt da waters, modificato per masse elevate. Prima di caricare il campione proteico, calibrare lo spettrometro di massa utilizzando ioduro di cesio.

Preparare innanzitutto una soluzione di 100 milligrammi per millilitro di cesio in acqua purificata; il cesio viene utilizzato per la calibrazione ad alta massa. Poiché i cluster di sale semplicemente carichi si estendono su un'ampia gamma di masse, da un rapporto massa/carica di 393 fino a oltre 10.000, utilizzare pinzette arrotondate per prelevare una capillare rivestita dalla piastra di Petri e caricare due microlitri della soluzione di cesio all'interno della capillare.

Utilizzando una punta caricata con gel einor, far scivolare la soluzione verso l'estremità del capillare, manualmente o con un adattatore per centrifuga. Inserire il capillare nel supporto per capillari e regolarlo in modo che la punta si trovi a circa 10 millimetri dal bordo del supporto.

Posizionare il capillare sotto un microscopio ottico e utilizzare pinzette affilate di tipo AA per tagliare la punta. È fondamentale verificare che non siano presenti bolle d'aria all'interno del capillare, in quanto potrebbero ostruire il flusso, e che il capillare non sia ostruito. Inoltre, accertarsi che il rivestimento in oro non si sia staccato dal capillare.

In caso affermativo, sostituire il capillare oppure tagliarne la punta ed eliminare la sezione non rivestita. Successivamente, collegare il supporto del capillare all'interfaccia ESI a flusso nanometrico. Ruotare lo stadio XY, Z all'indietro per evitare di danneggiare il capillare e spingere lo stadio nella sua posizione attivata.

Il capillare deve essere posizionato a una distanza compresa tra uno e dieci millimetri dall'orifizio del cono. Applicare una tensione al capillare e una bassa pressione di flusso nanolitri fino a quando non inizia lo spray. Successivamente, provare a ridurre la pressione di flusso nanolitri al valore minimo.

Ottimizzare l'intensità del segnale regolando la posizione dello stage XYZ, la tensione del capillare, la pressione del flusso nano e il flusso del gas di desolvatazione. Per rilevare un'ampia gamma di massa delle serie di picchi stagionali, è necessario ottimizzare le tensioni di accelerazione. I parametri utilizzati in questo caso sono: capillare da 1,3 a 1,7 chilovolt, cono del campione da 80 a 150 volt, cono di estrazione da uno a tre volt, per ottimizzare la trasmissione degli ioni ad alta massa, che richiedono condizioni di desalazione delicate.

La pressione di controbilanciamento viene aumentata a cinque-sei millibar nella fase iniziale di vuoto tra la sorgente e l'analizzatore. Per aumentare la pressione di controbilanciamento, ridurre con attenzione la conduttanza della linea di vuoto della sorgente verso la pompa a spirale chiudendo parzialmente la valvola di isolamento, monitorando al contempo l'effetto sull'intensità del segnale. Dopo aver configurato completamente gli spettrometri di massa, acquisire circa 30 scansioni a una scansione al secondo in un intervallo di rapporto carica principale compreso tra 1000 e 15.000, quindi calibrare il tempo di volo utilizzando la tabella di calibrazione appropriata.

Ora che la calibrazione è completa, è possibile caricare il campione proteico. Il campione deve essere preparato prima della calibrazione dello spettrometro di massa, richiedendo concentrazioni nell'ordine dei micromoli bassi. Se necessario, concentrare il campione utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga.

Verificare che il complesso proteico non venga assorbito sulla membrana del dispositivo prima dell'uso. Per controllare il volume e l'assorbanza UV, possono essere utilizzate solo soluzioni volatili, rendendo spesso necessario lo scambio di tampone. Una colonna di filtrazione su gel per microcentrifuga può essere impiegata per rimuovere ogni traccia di sali, molecole tampone o qualsiasi altro addotto non volatile.

Invece, sospendere il campione in una soluzione acquosa di acetato di ammonio. Questo passaggio critico determina la qualità degli spettri.

Ripetere lo scambio del tampone fino a tre volte con una diluizione minima, inferiore a un fattore di 1,3 per dispositivo, fino al raggiungimento dello scambio massimo. Se sono richiesti sia la concentrazione che lo scambio del tampone, questi possono essere eseguiti contemporaneamente utilizzando la filtrazione ultrafiltrante centrifuga, come mostrato all'inizio di questa sezione. Successivamente, caricare il campione come indicato per la calibrazione con ioduro di cesio e avviare la nebulizzazione.

Iniziare con un'ottimizzazione iniziale dello spray finché non viene rilevato il segnale. Utilizzare l'equazione per lo stato di carica medio mostrata, in cui M è la massa del complesso. Tuttavia, in Dalton, la posizione esatta degli stati di carica dipende dalla proteina.

Per evitare la dissociazione del complesso, non riscaldare la fonte di ferro. Spegnere il riscaldatore oppure mantenere la temperatura al di sotto di 40 gradi Celsius. Variare la posizione del capillare, della punta del campione e delle tensioni dell'estratore.

Per massimizzare la trasmissione del ferro, un possibile punto di partenza è la tensione del cono, 100 volt per il cono estrattore, un volt e una tensione capillare di 1,5 chilovolt. Verificare la variazione risultante negli spettri. Ottimizzare questi parametri in combinazione con una pressione a flusso nanometrico per migliorare la desolvatazione ed eliminare i componenti residui di acqua e tampone.

Aumentare la tensione di polarizzazione in funzione della pressione del gas nella cella di collisione. Le tensioni di polarizzazione tipiche rientrano nell'intervallo da 10 a 100 volt con un flusso di gas trappia da uno a 10 millilitri al minuto. Eseguire questa operazione con attenzione per evitare l'associazione del complesso, regolando le energie di collisione della trappia e del trasferimento.

Spesso sono richieste tensioni più elevate, solitamente comprese tra 10 e 30 volt, per la trasmissione di ioni ad alta massa. A questo punto, è importante evitare la dissociazione indotta da collisione del complesso, come mostrato qui. Una volta raggiunto un segnale stabile, si raccomanda di ridurre la pressione del flusso nano e la tensione del capillare ai valori minimi, mantenendo comunque uno spruzzo stabile.

Dopo aver acquisito diverse scansioni, procedere all'identificazione dei componenti del complesso mediante spettrometria di massa in tandem. Una volta ottenuto un segnale ottimale e stabile per il complesso proteico, selezionare uno ione precursore e impostare il centro di massa nella larghezza di isolamento. In genere, utilizzare una risoluzione massica bassa pari a 12 e una risoluzione massica alta compresa tra 13 e 15, adottando un ampio intervallo di massa per rilevare i prodotti di dissociazione ad alta massa e bassa carica, quindi ridurre tale intervallo ai valori desiderati per eseguire la ms.

Lo spettrometro di massa dissocia il complesso precursorio del ferro aumentando l'energia di collisione, abbreviata CE, e la pressione nella cella di collisione: aumentare gradualmente la CE del trappolamento o del trasferimento a passi di 10-20 volt ed elevare la pressione del gas di collisione da zero a cinque millilitri al minuto. Monitorare le variazioni negli spettri finché non vengono raggiunte le condizioni ottimali di attivazione. Un'elevata energia di attivazione può indurre la dissociazione di una o più subunità dal complesso integro, chiarificando così le affinità di interazione tra le diverse subunità.

Selezionare più di una carica per l'analisi MS in spettrometria di massa. Nel caso di componenti sovrapposti, l'acquisizione di un insieme di spettri di tandem MS aiuta a risolvere la serie di cariche delle diverse popolazioni. Inoltre, gli stati di carica più elevati si dissociano più facilmente rispetto agli stati di carica più bassi; sovrapporre quindi lo spettro MS e lo spettro ms.

Spettri Ms per convalidare l'isolamento dell'ione precursore scelto. Oltre alla caratterizzazione del complesso integro mediante MS e ms, MS genera sotto-complessi più piccoli in soluzione in condizioni di denaturazione lievi e caratterizza anche questi.

L'analisi MS e ms MS di sottocomplessi costituisce la base per definire l'architettura delle subunità del complesso; per una parziale interruzione delle interazioni tra subunità, aggiungere gradualmente solventi organici fino a una concentrazione del 50% oppure modificare il pH della soluzione aggiungendo ammoniaca o acido formico fino a una concentrazione del 4%. Infine, per determinare le masse delle singole subunità che compongono il complesso, è importante acquisire lo spettro in condizioni denaturanti. Questo può essere eseguito utilizzando una zip tip C4 con un rapporto acqua-acetonitrile compreso tra il 25 e il 75% e l'acido formico all'1% come solvente eluente. Tutti i dati raccolti devono essere elaborati e analizzati secondo quanto dettagliato nel protocollo scritto allegato. Prima di caricare il campione del complesso proteico, gli spettrometri di massa vengono calibrati utilizzando ioduro di cesio.

La serie di picchi equidistanti evidenziati in rosso si estende su un ampio intervallo, da un rapporto di carica principale di 393 a oltre 10.000. Tali picchi sono attribuiti a cluster salini semplicemente carichi con una composizione generale del complesso contenente cesio. Ulteriori segnali tra i picchi principali indicati in nero sono causati da specie doppiamente e triplamente cariche della serie del complesso di cesio 2+ e del complesso di cesio 3+.

Aumentare la pressione nella fase iniziale di vuoto è essenziale per rilevare gli aggregati ad alta massa. L'effetto della pressione sui picchi ad alta massa è qui dimostrato con valori di pressione di 1,2 e 5,3 millibar. Lo spettro di massa a pressione più elevata è mostrato ingrandito in questo caso.

Di seguito è riportato un esempio di spettrometria di massa di un complesso di variante lectinica che genera una distribuzione degli stati di carica compresa tra 3000 e 5.000 rapporto massa/carica. Tuttavia, a causa di un'adeguata desalificazione degli ioni, i picchi sono larghi. Aumentando la tensione di polarizzazione da quattro a 15 volt, il che comporta un incremento delle condizioni di accelerazione, si verifica la rimozione di acqua residua e componenti del tampone, ottenendo uno spettro altamente risolto; la massa misurata corrisponde a un complesso pentamerico.

Lo stato di carica +15 è stato quindi selezionato per l'analisi in spettrometria di massa tandem. L'aumento dell'energia di collisione provoca il rilascio di un monomero altamente carico centrato a un rapporto massa/carica di 1.664 e di un complesso tetramerico privo di subunità nell'intervallo di rapporto massa/carica compreso tra 5.000 e 8.000. Il complesso della variante della lectina è stato inoltre esaminato in condizioni denaturanti, portando all'associazione del complesso.

In questo modo, è possibile determinare la massa esatta delle singole subunità che compongono il complesso. Vi abbiamo appena mostrato come acquisire spettri MS e spettri di tandem MS di ioni ad alta massa. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale preparare correttamente il campione e utilizzare esclusivamente tamponi volatili compatibili con la spettrometria di massa.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.