Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di caratterizzare grandi assemblaggi proteici utilizzando la spettrometria di massa strutturale. Ciò si ottiene preparando capillari placcati in oro per la ionizzazione elettrospray a flusso nanometrico. In una seconda fase, il campione viene preparato e lo spettrometro di massa viene calibrato per misure di massa elevata.

Successivamente, le condizioni sperimentali vengono ottimizzate al fine di mantenere intatti i complessi proteici nella fase gassosa. Vengono quindi acquisiti MS e Ms.Spectra in tandem. Gli spettri MS hanno mostrato stati di carica corrispondenti in massa al complesso intatto, mentre gli esperimenti MS in tandem hanno prodotto un modello di associazione di monomeri e complessi spogliati.

Ciao, sono Naam Kiba dal laboratorio di Miron nel Whiteman Institute of Science, e sono Isaac Ky.Sono anche dal laboratorio di michelon. Oggi vorremmo mostrarvi la procedura di base per l'analisi di grandi complessi proteici applicando la spettrometria strutturale, e utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per caratterizzare i complessi proteici per definire la geometria, la composizione e le reti di interazione. Quindi iniziamo.

L'analisi dei complessi proteici legati non correnti viene eseguita mediante tecnica di immunizzazione a spruzzo d'aria utilizzando capillari emme plus o qua. Questo capillare C può essere tirato su una punta fine di circa un micron di diametro e quindi rivestito da materiale conduttore come l'oro. Questi capillari sono disponibili in commercio, come puoi vedere qui.

Tuttavia, è molto più conveniente da usare. I capillari di vetro, eh, che possono essere poi raffreddati e rivestiti allo stato di raffreddamento pronto per l'uso, vengono eseguiti su questo dispositivo di pooling dell'ago e il rivestimento su questo dispositivo di rivestimento eh. Per iniziare questa procedura, attacca due strisce di un tampone biadesivo sul fondo di una capsula di Petri, mantenendo le strisce a due centimetri di distanza.

Posiziona una bacchetta di vetro al centro di uno dei cuscinetti. Il tampone adesivo tiene i capillari in posizione e l'asta di vetro sostiene i capillari preparati e impedisce alle punte di rompersi per i capillari. Capillari in vetro silicato Boris usati con diametro esterno di un millimetro e diametro di 0,78 millimetri.

Inserire un capillare nell'ago, raggruppare delicatamente il capillare in posizione e regolarne la posizione in modo che si trovi al centro del filamento riscaldante. Stringere delicatamente i morsetti fino a quando i capillari non si tengono fermi su entrambe le estremità. Tirare il capillare utilizzando il programma predefinito mostrato qui.

Tuttavia, ricorda che il processo di programmazione dell'estrattore è fatto di tentativi ed errori. Fino a quando non si ottiene una forma accettabile della punta, ogni capillare estratto dà origine a due capillari di forma finale. Rimuovere i capillari estratti dallo strumento e ispezionare le punte, scartando quelle deformate o rotte.

Utilizzare una pinzetta di posizionamento smussato per posizionare i capillari nella capsula di Petri. La base dei capillari attaccati al tampone adesivo e la parte superiore si appoggia all'asta di vetro con la punta rivolta verso l'alto. Continuare a tirare i capillari fino a riempire la capsula di Petri.

Circa 80 capillari si inseriscono in un piatto di 10 centimetri di diametro. Quindi, ricopri i capillari con l'oro. Inserire la piastra nel coter sputter dorato.

Assicurarsi che l'alimentazione del gas sia scelta secondo le istruzioni del produttore e attivare un ciclo di verniciatura predefinito. Il rivestimento viene ripetuto da tre a sei volte fino a quando i capillari non sono uniformemente dorati. Una volta che i capillari sono pronti, procedere alla calibrazione dello spettrometro di massa.

La maggior parte degli esperimenti condotti sui complessi MultiPro sono eseguiti da uno spettrometro di massa a tempo di volo quadruplo Electrospray come questo. Inupt dalle acque, che è modificato per masse elevate. Prima di caricare il campione proteico, calibrare lo spettrometro di massa utilizzando ioduro di cesio.

Innanzitutto, preparare una soluzione di cesio da 100 milligrammi per millilitro in acqua purificata, il cesio viene utilizzato per la calibrazione di massa elevata. Poiché i grappoli di sale caricati singolarmente si estendono su un'ampia gamma di masse da 393 alberi al rapporto di carica a ben oltre 10.000. Usando una pinzetta smussata, prendi un capillare rivestito dalla capsula di Petri e carica due microlitri di soluzione di cesio nel capillare.

Utilizzando una punta caricata con gel einor. Far scorrere la soluzione verso la punta del capillare, manualmente o utilizzando un adattatore spin down. Inserire il capillare nel supporto del capillare e regolare il capillare in modo tale che la punta si trovi a circa 10 millimetri di distanza dal bordo del supporto.

Posizionare il capillare sotto un microscopio ottico e utilizzare pinzette affilate di tipo AA per tagliare la punta. È importante verificare che non vi siano bolle d'aria all'interno del capillare che potrebbero bloccare il flusso e che il capillare non sia ostruito. Inoltre, assicurarsi che il rivestimento d'oro non venga strappato dal capillare.

In tal caso, sostituire il capillare o tagliare la punta e rimuovere la sezione non rivestita. Quindi, collegare il supporto capillare all'interfaccia ESI nano flow. Ruotare il tavolino XY, Z all'indietro per evitare di danneggiare il capillare e spingere il tavolino nella sua posizione attivata.

Il capillare deve essere posizionato a una distanza compresa tra uno e 10 millimetri dall'orifizio del cono. Applicare una tensione capillare e una bassa pressione di flusso nano fino all'avvio della spruzzatura. Quindi prova a ridurre la pressione del flusso nano a un valore minimo.

Ottimizza l'intensità del segnale regolando la posizione dello stadio XYZ, la tensione capillare, la pressione del flusso nano e il flusso di gas di dissallazione. Per rilevare un'ampia gamma di masse delle serie di picchi stagionali, le tensioni di accelerazione devono essere ottimizzate. I parametri utilizzati qui sono un cono campione capillare da 1,3 a 1,7 kilovolt da 80 a 150 volt, un cono di estrazione, da uno a tre volt per ottimizzare la trasmissione di ioni ad alta massa, che richiedono condizioni di desalinizzazione delicate.

La pressione di supporto viene aumentata a cinque o sei millibar nella fase iniziale del vuoto tra la sorgente e l'analizzatore. Per aumentare la contropressione, ridurre attentamente la conduttanza della linea del vuoto sorgente verso la pompa scroll chiudendo parzialmente la valvola di isolamento e monitorando l'effetto sull'intensità del segnale. Al termine dell'impostazione degli spettrometri di massa, raccogliere circa 30 scansioni a una scansione al secondo con un intervallo di rapporto di carica master compreso tra 1000 e 15.000 dopo l'acquisizione, calibrare il tempo di volo utilizzando l'apposita tabella di calibrazione.

Ora che la calibrazione è completa, il campione di proteine può essere caricato. Il campione viene preparato prima di calibrare lo spettrometro di massa, sono necessarie basse concentrazioni micromolari. Se necessario, concentrare il campione utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga.

Verificare che il complesso proteico non venga assorbito dalla membrana del dispositivo prima dell'uso. Controllando il volume e l'assorbanza UV, per NESI possono essere utilizzate solo soluzioni volatili, rendendo spesso necessaria la sostituzione del tampone. Una colonna di filtrazione su gel per microcentrifuga può essere utilizzata per rimuovere tutte le tracce di sali, molecole tampone o altri addotti non volatili.

Sospendere invece il campione. Una soluzione acquosa di acetato di ammonio. Questo passaggio critico determina la qualità degli spettri.

Ripetere la sostituzione del tampone fino a tre volte con una diluizione minima, inferiore a un fattore di 1,3 per dispositivo, fino a raggiungere la massima sostituzione. Se sono necessari sia la concentrazione che lo scambio di tamponi, questi possono essere eseguiti insieme utilizzando l'ultrafiltrazione centrifuga, come appena mostrato all'inizio di questa sezione. Quindi, caricare il campione come mostrato per la calibrazione dello ioduro di cesio e iniziare la spruzzatura.

Iniziare con l'ottimizzazione iniziale dello spray fino a quando non viene rilevato il segnale. Utilizzare l'equazione per lo stato di carica medio mostrato in cui M è la massa del complesso. Nei Dalton, tuttavia, l'esatta posizione degli stati di carica dipende dalle proteine.

Per evitare una dissociazione complessa, non riscaldare la fonte di ferro. Spegnere il riscaldatore o mantenere la temperatura al di sotto dei 40 gradi Celsius. Variare la posizione del capillare, il cono del campione e le tensioni dell'estrattore.

Per massimizzare la trasmissione del ferro, un possibile punto di partenza è la tensione del cono, il cono dell'estrattore a 100 volt, a un volt e la tensione capillare a 1,5 kilovolt. Controllare la variazione risultante negli spettri. Ottimizza questi parametri in combinazione con una pressione di flusso nano per migliorare la deificazione e rimuovere l'acqua residua e i componenti tampone.

Aumentare la tensione di polarizzazione nella pressione del gas nella cella di collisione. Le tensioni di polarizzazione tipiche sono comprese tra 10 e 100 volt con un flusso di gas di intercettazione compreso tra uno e 10 millilitri al minuto. Eseguire questa operazione con attenzione per prevenire l'associazione del complesso, regolare la trappola e trasferire le energie di collisione.

Spesso sono necessarie tensioni più elevate, di solito comprese tra 10 e 30 volt, per la trasmissione di ioni ad alta massa. A questo punto, è importante evitare la dissociazione indotta dalla collisione del complesso, come mostrato qui. Dopo aver raggiunto un segnale stabile, ha raccomandato di ridurre la pressione del flusso nano e la tensione capillare a valori minimi, mantenendo stabile lo spruzzo.

Dopo aver raccolto diverse scansioni, procedere all'identificazione dei componenti del complesso mediante spettrometria di massa tandem. Una volta ottenuto un segnale ottimale e stabile per il complesso proteico, selezionare uno ione precursore per impostare il centro di massa in ampiezza di isolamento. Generalmente una bassa risoluzione di massa di 12 e un'alta risoluzione di massa compresa tra 13 e 15 utilizzano un ampio intervallo di massa per rilevare i prodotti di dissociazione ad alta massa e bassa carica e quindi ridurlo ai valori desiderati per eseguire ms.

MS dissocia il ferro precursore Aumentando l'energia di collisione abbreviata CE e la pressione sulla cella di collisione, aumentare gradualmente la trappola o trasferire CE in incrementi da 10 a 20 volt e aumentare la pressione del gas di collisione da zero a cinque millilitri al minuto. Monitorare le variazioni degli spettri fino al raggiungimento delle condizioni ottimali di attivazione. Un'elevata energia di attivazione può indurre la dissociazione di una o più subunità dal complesso intatto e chiarire le affinità di interazione di diverse subunità.

Seleziona più di un addebito per l'analisi ms MS. Nel caso di componenti sovrapposti, l'acquisizione di un set di spettri MS tandem aiuta a risolvere la serie di cariche delle diverse popolazioni. Inoltre, gli stati di carica più alti si dissociano più facilmente rispetto agli stati di carica più bassi che si sovrappongono a MS e ms.

Ms per convalidare l'isolamento dello ione precursore scelto. Oltre alla caratterizzazione del complesso intatto mediante MS e MS, la MS genera sottocomplessi più piccoli e una soluzione in condizioni di denaturazione lieve e caratterizza anche questi.

L'analisi MS e MS MS dei sottocomplessi costituisce la base per definire l'architettura delle subunità del complesso per la parziale disgregazione delle interazioni delle subunità delle subunità, aggiungere gradualmente solventi organici fino a una concentrazione del 50% o modificare il pH della soluzione aggiungendo ammoniaca o acido formico fino a una concentrazione del 4%Infine, Per determinare le masse delle singole subunità che compongono il complesso, è importante acquisire lo spettro in condizioni di denaturazione. Questo può essere effettuato utilizzando la punta della cerniera C four con un rapporto di 25-75 acqua aceto nitrile con acido formico all'1% come solvente eluciano con tutti i dati raccolti processo e analizzare i risultati come dettagliato nel protocollo scritto allegato. Prima di caricare il campione del complesso proteico, gli spettrometri di massa hanno calibrato utilizzando ioduro di cesio.

La serie di picchi equidistanti contrassegnati in rosso si estende su un ampio intervallo da un rapporto di carica principale di 393 a ben oltre 10.000. Vengono assegnati a caricare singolarmente i cluster di sali della composizione generale del complesso cesio plus. Ulteriori segnali tra i picchi principali segnati in nero sono causati da specie di carica doppia e tripla del complesso della serie cesio due plus e del complesso cesio tre plus.

L'aumento della pressione nella fase iniziale del vuoto è essenziale per rilevare i cluster di massa elevata. L'effetto della pressione sui picchi di massa elevati è dimostrato qui con letture di pressione di 1,2 e 5,3 millibar. Lo spettro di massa per la pressione più alta è mostrato espanso qui.

Ecco un esempio di spettrometria di massa di un complesso variante di lectina che dà origine a una distribuzione dello stato di carica compresa tra 3000 e 5.000 rapporto di carica master. Tuttavia, a causa di un'adeguata desalinizzazione degli ioni, i picchi sono ampi. L'aumento della tensione di polarizzazione da quattro volt a 15 volt, che provoca un aumento delle condizioni di accelerazione, provoca lo strippaggio dell'acqua residua e dei componenti tampone producendo uno spettro ad alta risoluzione, la massa misurata corrisponde a un complesso pentamerico.

Lo stato di carica più 15 è stato quindi selezionato per l'analisi MS tandem. L'aumento dell'energia di collisione provoca il rilascio di un monomero altamente carico centrato a 1.664 rapporto di carica principale e di un complesso tetramerico spogliato nell'intervallo di 5.000-8.000 rapporto di carica di massa. Il complesso della variante della lectina è stato esaminato anche in condizioni denaturanti che portano a un'associazione complessa.

In questo modo è possibile determinare con precisione la massa delle singole subunità che compongono il complesso. Ti abbiamo appena mostrato come acquisire MS e Ms in tandem spettri di ioni ad alta massa. Quando si esegue questa procedura, è importante preparare adeguatamente il campione e utilizzare solo tamponi di volatilità compatibili con la spettrometria di massa.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.