Name: Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Impara a caratterizzare grandi complessi proteici mediante spettrometria di massa strutturale. Questo protocollo dettagliato mostra come preparare capillari placcati in oro, calibrare lo spettrometro e ottimizzare le condizioni sperimentali per mantenere intatti i complessi proteici durante l'analisi.

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Gli autori ringraziano i membri del gruppo di Sharon per la loro revisione critica e per il loro contributo al manoscritto. Siamo grati per il sostegno dei Programmi Morasha e Bikura, la Israel Science Foundation (Grant numeri 1823-1807 e 378/08), Josef Cohn Minerva Centro per la Ricerca Biomembrane, il Programma per la Famiglia Chais Fellows nuovi scienziati, Abramo e Sonia Rochlin Fondazione, la famiglia Wolfson Charitable Trust, la Helen e Milton A. Kimmelman Centro per la Struttura Biomolecolari e dell&#39;Assemblea, la tenuta di Shlomo e Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Regno Unito. Siamo grati a Dan Tawfik e Itamar Yadid per averci dato l&#39;esempio lectina variante.

Parte 1: Preparazione di oro rivestite capillari per la ionizzazione elettrospray nanoflussi Analisi di complessi non covalenti è di solito eseguita per mezzo di ionizzazione elettrospray nanoflussi (NESI) 6, con vetro o quarzo capillari che sono stati tirati a punta fine (diametro ~ 1 micron interno), e rivestiti con materiale conduttivo (di solito oro) . Tali capillari sono disponibili pronti per l'uso-da fonti commerciali (Nuovo obiettivo o Proxeon), tuttavia, può essere più conveniente per prepararli in casa: <ol><li> Bastone due strisce di una doppia faccia pad adesivo al fondo di una capsula di Petri, 2 cm di distanza. Inserire una bacchetta di vetro (8 cm x 5 mm) al centro di una delle pastiglie. Il pad adesivo terrà i capillari in posizione, e la bacchetta di vetro sosterrà il preparato capillari, e tenere le punte di rottura (Fig. 1). </li><li> Usa vetro borosilicato capillari, 1,0 mm x 0,78 mm di diametro (usiamo confezioni da 500 a pareti sottili capillari in borosilicato da Warner Instruments, cat. No. G100TF-4). Inserire una capillare nel estrattore ago (usiamo il modello P-97 dello strumento Sutter Co.). Bloccare il capillare dolcemente in posizione, e regolarne la posizione in modo che si trova nel centro del filamento di riscaldamento dell'ago di estrattore. Serrare i morsetti delicatamente, fino a quando il capillare è tenuto fermo alle due estremità. </li><li> Tirare il capillare, utilizzando un programma predefinito. Ogni capillare tirato darà luogo a due finali, a forma di capillari. Il processo di programmazione l'estrattore è uno dei tentativi ed errori, fino a una forma accettabile punta si ottiene. Noi usiamo il seguente programma: <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Calore </td><td> Tirare </td><td> Vell </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Rimuovere la tirato capillari dallo strumento e controllare le punte, scartando quelle che vengono deformati o rotti. Usa smussato pinzette (usiamo pinzette di precisione di posizionamento da CK), al posto dei capillari nella scatola di Petri. La base del capillare deve essere allegata al pad adesivo e la parte superiore deve appoggiarsi la bacchetta di vetro, con la punta rivolta verso l'alto. </li><li> Una volta che la capsula di Petri è pieno (circa 80 in forma capillari in un cm di diametro 10 piatto), inserire la piastra in oro sputter verniciatore (usiamo il modello no. EMS550, da EMS). Assicurarsi che il gas viene scelto in base alle istruzioni del produttore, e attivare un ciclo predefinito rivestimento (che usano la pressione Argon 4 PSI, ad una pressione di vuoto di 5 x 10 -2 mbar, una corrente di 45 mA, e un tempo di rivestimento di 1 min, per 3-6 cicli, fino a quando i capillari sono uniformemente dorate). </li></ol> Parte 2: Preparazione dei campioni <ol><li> Micromolari basse concentrazioni di campione sono tenuti (1 - 20 micron). Se necessario, concentrare l'esempio utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifugo (per esempio, Vivaspin Sartorius, o NanoSep da Pall Corporation). Si consiglia di verificare l'assorbimento del complesso proteina alla membrana dispositivo, prima dell'uso. </li><li> Spesso, i buffer di purificazione o di soluzioni di storage del complesso di proteine ​​non sono compatibili con Nesi, per cui solo soluzioni volatili possono essere utilizzati. Pertanto, buffer di scambio è necessario. Questa fase critica, in cui vengono rimosse tutte le tracce di sali, molecole tampone o qualsiasi altro non volatili addotti come il glicerolo, DTT, o EDTA, determina la qualità degli spettri. Di solito, soluzione acquosa di acetato di ammonio è usato, ad una concentrazione compresa tra 5 mm e 1 M, a 6-8 e pH. Buffer di scambio può essere eseguito utilizzando un gel colonna microcentrifuga filtrazione (ad esempio, Micro Bio-Spin 6 colonne cromatografiche da Bio-Rad). Questa operazione può essere ripetuta 1-3 volte con la diluizione minima (meno di un fattore pari a 1,3 per dispositivo 5), fino a quando lo scambio massimo è raggiunto. Se entrambi concentrazione e lo scambio di buffer sono necessari, questi possono essere fatto insieme, utilizzando ultrafiltrazione centrifuga (e, g., Vivaspin Sartorius, o NanoSep da Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibrazione lo spettrometro di massa per misure di massa ad alta La maggior parte degli esperimenti condotti su multi-proteina complessi vengono eseguite utilizzando un electrospray nano quadrupolo-tempo di volo (Q-TOF) strumento. Si consiglia di utilizzare un filtro quadrupolo di massa regolare alle basse frequenze, per consentire l'analisi e la trasmissione di massa di ioni ad alta m / z valori 7,8. E 'raccomanda inoltre di ingressi gas 7,8 o 9 maniche essere aggiunte allo strumento nella guida agli ioni di prima, per permettere il controllo della pressione nella fase di vuoto per primo. Quest'ultimo consente l'ottimizzazione della trasmissione, e desolvatazione di ioni molto grande 7-9. Attualmente, commerciale ESI-TOF e Q-ToF strumenti sono disponibili presso diversi produttori (per esempio, Waters, SCIEX, Bruker, o Agilent) che possono essere modificate in modo relativamente semplice e conveniente, per le applicazioni native di MS 7,8. E 'possibile, tuttavia, di utilizzare configurazioni standard o ToF QTof su strumenti come LCT o QToF1 (Waters) per acquisire spettri di massa per i complessi fino a 1 MDA, senza la necessità di modifiche hardware 5. Il protocollo descritto di seguito è stata condotta su uno strumento Synapt (Waters). <ol><li> La preparazione di 100 mg / ml soluzione di CsI in acqua purificata. CsI ​​è utilizzato per la calibrazione di massa elevata come i grappoli sale singolarmente carica, (CSI) n Cs + si estendono su una vasta gamma di massa, da 393 m / z a oltre 10.000 (Fig. 2). </li><li> Utilizzando le pinzette smussato, prendere un capillare rivestito dalla capsula di Petri e 2μL carico della soluzione di CsI nel capillare, utilizzando una punta GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserire il capillare nel supporto capillare, e regolare il capillare in modo che la punta è di circa 10 mm dal bordo del titolare. </li><li> Far scorrere la soluzione verso la punta del capillare sia manualmente, o usando un adattatore spin down. </li><li> Mettere il capillare sotto un microscopio ottico e tagliare la punta, con il forte AA-tipo pinzette. </li><li> Collegare il supporto capillare per l'interfaccia ES nanoflussi. Ruotare la fase xyz all'indietro per evitare di danneggiare i capillari, e spingere il palco nella sua posizione attivata. Il capillare deve essere collocato 1-10 mm dal cono orifizio. </li><li> Applicare la tensione capillare (1050-1400 V) e la pressione nanoflussi bassa (0,00-0,03 bar) fino a spruzzo è iniziata, quindi provare a ridurre la pressione nanoflussi ad un valore minimo. </li><li> Ottimizzare l'intensità del segnale, regolando la posizione del palco xyz, la tensione capillare, la pressione nanoflussi, e il flusso di gas desolvatazione. </li><li> Per rilevare una vasta gamma di massa di CsI picco di serie, le tensioni di accelerazione deve essere ottimizzata (usiamo i seguenti parametri: capillare 1,3-1,7 kV, cono di campione 80-150V, estrazione cono 1-3 V). </li><li> Per ottimizzare la trasmissione di ioni di massa elevata, quando le condizioni desolvatazione gentile, la pressione di sostegno nella fase di vuoto iniziale, tra la sorgente e l'analizzatore, dovrebbe essere aumentato. Ciò può essere ottenuto con attenzione riducendo la conduttanza della linea di vuoto di origine alla pompa di scorrimento, con la parziale chiusura della valvola di isolamento (SpeediValve). Al fine di definire il punto ottimale, il secondo dovrebbe essere fatto durante il monitoraggio l'effetto sulla intensità del segnale (di solito uso 3,0-6,5 mBar). </li><li> Raccogliere circa 30 scansioni a 1 scan / sec, con un m / z intervallo compreso tra 1.000 e 15.000 m / z. </li><li> Dopo l'acquisizione, calibrare il TOF usando la tabella di calibrazione. </li></ol> Parte 4: analisi MS di complessi proteici integri <ol><li> Caricare il campione, come descritto (Parte 3, sezioni 2-5), e avviare spray. </li><li> Inizia l'ottimizzazione iniziale del getto (parte 3, sezioni 6-9), fino a quando il segnale viene rilevato. L'esatta posizione degli stati di carica è la proteina-dipendente, tuttavia, può essere previsto, utilizzando la relazione tra la massa di ioni e stato di carica media, in questo modo: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), in cui m è la massa del complesso di Dalton. Per evitare complesso dissociazione, non scaldano il sorgente di ioni: o spegnere il riscaldatore, o mantenere la temperatura sotto i 40 ° C. </li><li> Variare la posizione capillare, cono campione e tensioni di aspirazione per massimizzare la trasmissione di ioni, e verificare con conseguente cambiamento di spettri. Un possibile punto di partenza potrebbe essere cono tensione di 100 V; estrattore cono: 1 V, la tensione capillare 1,5 kV. Ottimizzare questi parametri, in combinazione con la pressione nanoflussi. </li><li> Per migliorare desolvatazione e spogliano l'acqua residua e componenti tampone, aumentare la tensione di polarizzazione e la pressione del gas nella cella di collisione. Questa operazione deve essere eseguita con attenzione, per evitare che la dissociazione del complesso. Tensioni di polarizzazione tipiche sono nel range di 10-100 V, con un flusso di gas trappola di 1-10 ml / min (Fig. 3). Regolazione manuale della regolazione RF e il profilo quadrupolo può migliorare la trasmissione degli ioni di massa elevata. </li><li> Regolare il Trap e le energie di collisione di trasferimento. Spesso, tensioni superiori sono necessari per la trasmissione di ioni di massa elevata (di solito all'interno della gamma di 10-30 V). A questo punto, è importante per evitare la collisione indotta dissociazione del complesso. </li><li> Dopo un segnale stabile è reached, si raccomanda che la pressione e la tensione capillare nanoflussi essere ridotta a valori minimi, pur mantenendo stabile a spruzzo. </li></ol> Parte 5: la spettrometria di massa tandem: complessi proteici dissociare <ol><li> Una volta che un segnale ottimale e stabile è stato ottenuto, selezionare uno ione precursore. Impostare il centro di massa e la larghezza di isolamento (generalmente usiamo una risoluzione LM di 12 anni, e una risoluzione di HM tra 13 e 15). Utilizzare una vasta gamma di massa per individuare la massa alto / basso costo prodotti dissociazione. Si consiglia di impostare la m / z gamma al massimo livello, e poi ridurre a valori desiderati. Vi proponiamo la sovrapposizione di MS e MS / MS spettri, per convalidare l'isolamento dello ione precursore selezionato. </li><li> Per eseguire MS / MS, dissociare lo ione precursore, aumentando l'energia di collisione (CE) e la pressione sulla cella di collisione. Aumentare sia Trappola o Bonifico CE gradualmente, con incrementi di 10-20V, ed elevare la pressione del gas di collisione a 0-5 ml / min (valori comuni). Monitorare i cambiamenti negli spettri fino a condizioni di attivazione ottimali si raggiungono. Energia di attivazione elevata può indurre la dissociazione di una o più subunità dal complesso intatto, e chiarire le affinità interazione di diverse subunità. Usiamo tipicamente Argon come gas di collisione nella trappola / trasferimento cellule, anche se i benefici di utilizzare un gas più pesante (ad esempio, Xe o SF 6) sono stati segnalati, tuttavia, questi gas sono sostanzialmente più costose 11 (Fig. 3). </li><li> Si raccomanda che più di uno stato di carica essere selezionato per MS / MS. Nel caso di componenti sovrapposte, acquisendo una serie di tandem MS spettri aiuterà a risolvere la serie di carica delle diverse popolazioni. Inoltre, stati di carica più alta si dissociano più facilmente, rispetto a stati di carica inferiore 12. </li><li> Oltre alla caratterizzazione del complesso intatto, si suggerisce che i piccoli subcomplessi in soluzione verrà generato, in condizioni di lieve denaturazione. Le analisi MS e MS / MS di subcomplessi costituiscono la base per definire l'architettura subunità del complesso 13. Per l'interruzione parziale della subunità-subunità interazioni, aggiungere gradualmente solventi organici (ad esempio metanolo, isopropanolo o acetonitrile) fino ad una concentrazione del 50%, o modificare il pH della soluzione con l'aggiunta di ammoniaca o acido formico (fino ad una concentrazione di 4 %). </li><li> Per determinare le masse delle singole unità che compongono il complesso, è importante acquisire uno spettro in condizioni di denaturazione. Questo può essere effettuata con Zip-Tip C 4 (Millipore) con 25:75 acqua / acetonitrile rapporto, con 1% di acido formico come solvente di eluizione. </li></ol> Parte 6: L'elaborazione dei dati e analisi <ol><li> I dati vengono analizzati in linea, con un programmi di analisi spettrale per MS spettri. Noi di solito utilizzare il programma MassLynx (Waters). </li><li> Per spettri che abbracciano un ampio m / z gamma, si consiglia di diversi regimi di levigatura e centroide parametri da applicare per l'alta e bassa m / z regioni, per riflettere la differenza di risoluzione di punta di queste regioni. </li><li> Per identificare serie di carica e di calcolare gli stati di carica e le masse, il "Manuale di trovare" la funzione di MassLynx può essere applicata. In caso di spettri di massa complessi con componenti sovrapposti, calcolo manuale delle masse può essere più facile. </li><li> Per facilitare questi processi di assegnazione, software aggiuntivo può essere utilizzato, ad esempio: Maxent per deconvoluzione spettri 14, SOMMS per il montaggio e la simulazione di picco 15 e SUMMIT per assegnare la composizione e la stechiometria di subcomplessi proteine ​​e la generazione di reti di interazione proteina 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparazione di oro rivestite nano-elettrospray capillari. A. Fissare due su due lati strisce adesive di una capsula di Petri, 2 cm di distanza. Per supportare la preparazione capillari, posto una bacchetta di vetro (8 cm x 5 mm) al centro di una delle pastiglie. B. Stick l'estremità piatta del preparato capillari al pad adesivo, e appoggiarsi sulla punta sulla bacchetta di vetro. C. Una volta che la piastra di Petri è riempito con il preparato capillari, cappotto d'oro fino a un sottile strato di oro è depositato in modo uniforme sulla superficie esterna dei capillari. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calibrazione di massa ad alta utilizzando ioni ioduro di cesio. I cluster di grandi dimensioni e monisotopic di CSI hanno reso il composto di scelta per la calibrazione di spettrometri di massa per l'analisi di massa elevata. La serie di picchi equidistanti si estendono su una vasta gamma, da m / z 393 a ben oltre 10.000. Sono ASSIGned singolarmente a carico cluster sale della composizione generale (CSI) n Cs +. Segnali supplementari tra le cime principali sono causati da specie a doppia e tripla carica della serie, [(CSI) n CS2] 2 + e [(CSI) n Cs3] 3 +, rispettivamente. Aumentando la pressione nella fase di vuoto iniziale è essenziale per rilevare il cluster di massa elevata. L'effetto della pressione sui picchi di massa elevata è dimostrato in pannelli A. e B. con readback pressione di 1,2 e 5,3, rispettivamente. C. Espansione dello spettro di massa mostrato in B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Nanoflussi elettrospray spettri di massa di una lectina pentamerica. A. Spettrometria di massa di una complessa variante lectina (derivato da Lib1-B7 dall'evoluzione diretto 18) dà luogo a distribuzioni stato una carica tra 3.000 e 5.000 m / z, tuttavia, a causa di desolvatazione inadeguata degli ioni, i picchi sono ampie. Confronto di gruppo A. e B. mostrare l'effetto di aumentare la tensione di polarizzazione da 4V (A). A 15 V (B). Sulla larghezza del picco. Questo aumento in condizioni di accelerazione provoca la rimozione dei residui di acqua e componenti di buffer, producendo uno spettro estremamente risolto. La massa misurata (60.240 ± 38 Da) corrisponde ad un complesso pentamerica. C. Il 15 dello stato di carica è stato poi selezionato per il tandem MS (in grigio nel pannello B). D. L'aumento di energia di collisione provoca il rilascio di un monomero altamente carica, centrata a 1.664 m / z, e un complesso spogliato tetramerica, nella gamma di 5.000 - 8.000 m / z. Tutti gli spettri sono stati ottenuti da un campione contenente 20 mM di soluzione in acetato di ammonio 0,5 M.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per acquisire gli spettri di alta qualità l&#39;attenzione dovrebbe essere data alle fasi di preparazione del campione, tra cui la concentrazione del campione e lo scambio di buffer. Oltre campioni diluiti darà un segnale basso, mentre i campioni ad alta concentrazione può essere piuttosto viscoso, e bloccare l&#39;ago elettrospray. Inoltre, additivi soluzione come sali, glicerina, detergenti, ioni metallici, e agenti riducenti (DTT o β-mercaptoetanolo), tendono ad aderire alla superficie esterna delle proteine, e la causa allargamento dei picchi. Pertanto, al fine di raggiungere picchi ben risolti, questi componenti dovrebbe essere aggiunto al minor concentrazione possibile. Un altro parametro chiave è la posizione del nanoflussi capillare, rispetto al foro spettrometro di massa. Trovare il &quot;sweet spot&quot; potrebbe essere difficile per gli utenti meno esperti, tuttavia, influenza in modo significativo la qualità degli spettri. E &#39;anche importante esaminare la nanoflussi capillare prima di iniziare a spruzzo. La dimensione delle gocce è una funzione del diametro della punta, che dovrebbe essere ~ 1μm. Piccole gocce portare a ionizzazione più efficiente, e sarebbe quindi vantaggioso. E &#39;anche importante per verificare che non vi siano bolle d&#39;aria all&#39;interno del capillare che potrebbero bloccare il flusso, e che il rivestimento d&#39;oro non è spogliato dal capillare durante l&#39;acquisizione, in caso affermativo, ulteriormente tagliare la punta. Tenete presente che una eccessiva quantità di campione aumenta la possibilità di ottimizzare le condizioni di SM come la tensione capillare, tensioni di accelerazione, pressione, e l&#39;energia di collisione. Nel complesso, le procedure spiegate nel protocollo sono stati utilizzati per determinare la composizione, stechiometria e l&#39;architettura di complessi proteici diversi (vedi recensioni 2,3,4). Analisi dei grandi complessi MDA come il ribosoma 19 e capsidi virus altamente ordinato 20-22, nella definizione del substrato legame con macchine molecolari 23-25, o la caratterizzazione delle reti di interazione subunità 26,17,16,17,27,28 servire come solo alcuni esempi del valore di questo approccio.

Esempio di requisiti: <table border="1"><tr><td> Campione </td><td> Requisito </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 microlitri </td><td> Per capillare </td></tr><tr><td> Concentrazione </td><td> 1-20μM </td><td> Per complessi </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Tampone Aquanos volatili come ammonio acetato a pH = 6-8 </td><td> Tipicamente 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Minimo </td><td> Gruppi di molecole detergenti produrre picchi ampio e irrisolto </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Minima (massimo 5%) </td><td> Aderisce non specifico alle proteine ​​e, di conseguenza, vette largo vengono osservati </td></tr><tr><td> Solventi organici </td><td> Fino al 50% </td><td> Potrebbe denaturare le proteine ​​complessi </td></tr><tr><td> Acidi </td><td> Fino al 4% </td><td> Denaturare complessi proteici </td></tr><tr><td> Sali </td><td> Minimo </td><td> Addotti sale portare a picchi di ampio e irrisolto </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimo </td><td> MM 1-2 possono essere presenti </td></tr><tr><td> Agenti chelanti </td><td> Minimo </td><td> Superiori a 250 mM portare alla formazione di addotti ampia </td></tr></table>

analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Cellule viventi controllare e regolare i loro processi biologici attraverso l&#39;azione coordinata di un gran numero di proteine ​​che si assemblano in un array di dinamica e multi-proteina complessi 1. Per ottenere una comprensione meccanicistica dei vari processi cellulari, è fondamentale per determinare la struttura di tali complessi proteici, e rivelano come la loro organizzazione strutturale impone la loro funzione. Molti aspetti della multi-proteina complessi, tuttavia, sono difficili da caratterizzare, a causa della loro natura eterogenea, la struttura asimmetrica e dinamica. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per lo studio dei livelli di organizzazione terziaria delle proteine. Uno degli strumenti emergenti biologia strutturale per l&#39;analisi di complessi macromolecolari è la spettrometria di massa (MS) 2-5. Questo metodo fornisce informazioni sulla composizione proteica complessa, stechiometria subunità, e la topologia strutturale. Il potere del MS deriva dalla sua elevata sensibilità e, come, requisito campione conseguenza bassa, che consente l&#39;esame di complessi proteici espressi a livelli endogeni. Un altro vantaggio è la velocità di analisi, che permette il monitoraggio delle reazioni in tempo reale. Inoltre, la tecnica può misurare contemporaneamente le caratteristiche di popolazioni separate che coesistono in una miscela. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l&#39;applicazione della strutturali MS per l&#39;analisi di assiemi di grandi dimensioni delle proteine. La procedura inizia con la preparazione di oro rivestite capillari per la ionizzazione elettrospray nanoflussi (NESI). Si prosegue poi con la preparazione del campione, sottolineando le condizioni di buffer che dovrebbe essere compatibile con NESI da un lato, e permettono di mantenere intatta complessi dall&#39;altro. Abbiamo poi spiegare, passo per passo, come ottimizzare le condizioni sperimentali per misure di massa elevata e acquisire MS e MS tandem spettri. Infine, la tabella di elaborazione dati e le analisi che seguono. Piuttosto che tentare di caratterizzare ogni aspetto delle assemblee proteine, questo protocollo introduce le procedure di base di MS, che consente l&#39;esecuzione di esperimenti MS e MS / MS di non covalenti complessi. Nel complesso, il nostro obiettivo è quello di fornire ai ricercatori che non conosce con il campo di MS strutturale, con conoscenza dei principali strumenti sperimentali.

Spettrometria di massa ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l&#39;analisi dei complessi proteici di grandi dimensioni. Questo metodo consente intuizioni l&#39;architettura composizione, stechiometria e in generale di multi-subunità assemblee. Qui, descriviamo, passo per passo, come effettuare una analisi strutturale spettrometria di massa, e caratterizzare le strutture macromolecolari.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Le cellule viventi controllano e regolano i propri processi biologici attraverso l'azione coordinata di un gran numero di proteine che si assemblano in un...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare grandi complessi proteici mediante spettrometria di massa strutturale. Questo viene ottenuto preparando capillari placcati in oro per l'elettrospruzzo nano-flow. Come secondo passaggio, il campione viene preparato e lo spettrometro di massa viene calibrato per misurazioni ad alta massa. In seguito, le condizioni sperimentali vengono ottimizzate per mantenere intatti i complessi proteici nella fase gassosa. Vengono quindi acquisite le spettrometrie di massa (MS) e le spettrometrie tandem MS. Gli spettri MS hanno mostrato stati di carica corrispondenti in massa al complesso integro, mentre gli esperimenti di MS tandem hanno fornito il profilo di associazione dei monomeri e dei complessi depurati.Ciao, sono Naam Kiba del Laboratorio di Miron presso l'Istituto di Scienze Whiteman, e io sono Isaac Ky. Anch'io provengo dal laboratorio di Michelon. Oggi vorremmo mostrarvi la procedura di base per analizzare complessi proteici di grandi dimensioni applicando la spettrometria strutturale, e utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per caratterizzare complessi proteici al fine di definirne la geometria stocastica, la composizione e le reti di interazione. Cominciamo dunque.L'analisi di complessi proteici non correnti viene eseguita mediante la tecnica di immunizzazione a spruzzo aereo, utilizzando capillari emme plus o a qua. Questo capillare C può essere tirato fino a ottenere una punta fine di circa un micron di diametro e successivamente rivestito con un materiale conduttivo come l'oro. Questi capillari sono disponibili in commercio, come si può vedere qui.Tuttavia, è molto più conveniente da utilizzare. Le capillari di vetro, ehm, che possono essere raffreddate e rivestite fino allo stato pronto all'uso, vengono sottoposte a raffreddamento su questo dispositivo di raccolta degli aghi e rivestimento su questo dispositivo di rivestimento, ehm. Per iniziare questa procedura, applicare due strisce di un tappetino adesivo bifacciale sul fondo di una piastra di Petri, mantenendo le strisce distanti due centimetri l'una dall'altra.Posizionare una bacchetta di vetro al centro di uno dei cuscinetti. Il cuscinetto adesivo tiene ferme le capillari e la bacchetta di vetro sostiene le capillari preparate, impedendo che le punte si rompano. Utilizzare capillari in vetro borosilicato Boris con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,78 millimetri.Inserire un capillare nell'ago, posizionarlo delicatamente e regolarne la posizione in modo che si trovi al centro del filamento riscaldante. Stringere delicatamente le pinze fino a quando i capillari risultano saldamente fissati alle due estremità. Tirare il capillare utilizzando il programma predefinito mostrato qui.Tuttavia, ricordare che il processo di programmazione della macchina per la trazione è basato su tentativi ed errori. Fino a quando non si ottiene una forma della punta accettabile, ogni capillare tirato produce due capillari finali con la forma desiderata. Rimuovere i capillari tirati dall'apparecchio ed esaminarne le punte, scartando quelli deformi o rotti.Utilizzare pinzette posizionatrici smussate per posizionare i capillari nella piastra di Petri. La base dei capillari è attaccata al cuscinetto adesivo e la parte superiore poggia sulla bacchetta di vetro con la punta rivolta verso l'alto. Continuare a posizionare i capillari fino a quando la piastra di Petri non sarà piena.Circa 80 capillari entrano in una piastra di 10 centimetri di diametro. Successivamente, rivestire i capillari con oro. Inserire la piastra nel rivestitore a sputtering d'oro.Assicurarsi che l'alimentazione del gas sia scelta secondo le istruzioni del produttore e attivare un ciclo di rivestimento predefinito. Il rivestimento viene ripetuto da tre a sei volte fino a quando i capillari non assumono un colore dorato uniforme. Una volta che i capillari sono pronti, procedere con la calibrazione dello spettrometro di massa.La maggior parte degli esperimenti condotti sui complessi MultiPro viene eseguita mediante uno spettrometro di massa a quadrupolo con elettrospray e tempo di volo, come questo. Inupt da waters, modificato per masse elevate. Prima di caricare il campione proteico, calibrare lo spettrometro di massa utilizzando ioduro di cesio.Preparare innanzitutto una soluzione di 100 milligrammi per millilitro di cesio in acqua purificata; il cesio viene utilizzato per la calibrazione ad alta massa. Poiché i cluster di sale semplicemente carichi si estendono su un'ampia gamma di masse, da un rapporto massa/carica di 393 fino a oltre 10.000, utilizzare pinzette arrotondate per prelevare una capillare rivestita dalla piastra di Petri e caricare due microlitri della soluzione di cesio all'interno della capillare.Utilizzando una punta caricata con gel einor, far scivolare la soluzione verso l'estremità del capillare, manualmente o con un adattatore per centrifuga. Inserire il capillare nel supporto per capillari e regolarlo in modo che la punta si trovi a circa 10 millimetri dal bordo del supporto.Posizionare il capillare sotto un microscopio ottico e utilizzare pinzette affilate di tipo AA per tagliare la punta. È fondamentale verificare che non siano presenti bolle d'aria all'interno del capillare, in quanto potrebbero ostruire il flusso, e che il capillare non sia ostruito. Inoltre, accertarsi che il rivestimento in oro non si sia staccato dal capillare.In caso affermativo, sostituire il capillare oppure tagliarne la punta ed eliminare la sezione non rivestita. Successivamente, collegare il supporto del capillare all'interfaccia ESI a flusso nanometrico. Ruotare lo stadio XY, Z all'indietro per evitare di danneggiare il capillare e spingere lo stadio nella sua posizione attivata.Il capillare deve essere posizionato a una distanza compresa tra uno e dieci millimetri dall'orifizio del cono. Applicare una tensione al capillare e una bassa pressione di flusso nanolitri fino a quando non inizia lo spray. Successivamente, provare a ridurre la pressione di flusso nanolitri al valore minimo.Ottimizzare l'intensità del segnale regolando la posizione dello stage XYZ, la tensione del capillare, la pressione del flusso nano e il flusso del gas di desolvatazione. Per rilevare un'ampia gamma di massa delle serie di picchi stagionali, è necessario ottimizzare le tensioni di accelerazione. I parametri utilizzati in questo caso sono: capillare da 1,3 a 1,7 chilovolt, cono del campione da 80 a 150 volt, cono di estrazione da uno a tre volt, per ottimizzare la trasmissione degli ioni ad alta massa, che richiedono condizioni di desalazione delicate.La pressione di controbilanciamento viene aumentata a cinque-sei millibar nella fase iniziale di vuoto tra la sorgente e l'analizzatore. Per aumentare la pressione di controbilanciamento, ridurre con attenzione la conduttanza della linea di vuoto della sorgente verso la pompa a spirale chiudendo parzialmente la valvola di isolamento, monitorando al contempo l'effetto sull'intensità del segnale. Dopo aver configurato completamente gli spettrometri di massa, acquisire circa 30 scansioni a una scansione al secondo in un intervallo di rapporto carica principale compreso tra 1000 e 15.000, quindi calibrare il tempo di volo utilizzando la tabella di calibrazione appropriata.Ora che la calibrazione è completa, è possibile caricare il campione proteico. Il campione deve essere preparato prima della calibrazione dello spettrometro di massa, richiedendo concentrazioni nell'ordine dei micromoli bassi. Se necessario, concentrare il campione utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga.Verificare che il complesso proteico non venga assorbito sulla membrana del dispositivo prima dell'uso. Per controllare il volume e l'assorbanza UV, possono essere utilizzate solo soluzioni volatili, rendendo spesso necessario lo scambio di tampone. Una colonna di filtrazione su gel per microcentrifuga può essere impiegata per rimuovere ogni traccia di sali, molecole tampone o qualsiasi altro addotto non volatile.Invece, sospendere il campione in una soluzione acquosa di acetato di ammonio. Questo passaggio critico determina la qualità degli spettri.Ripetere lo scambio del tampone fino a tre volte con una diluizione minima, inferiore a un fattore di 1,3 per dispositivo, fino al raggiungimento dello scambio massimo. Se sono richiesti sia la concentrazione che lo scambio del tampone, questi possono essere eseguiti contemporaneamente utilizzando la filtrazione ultrafiltrante centrifuga, come mostrato all'inizio di questa sezione. Successivamente, caricare il campione come indicato per la calibrazione con ioduro di cesio e avviare la nebulizzazione.Iniziare con un'ottimizzazione iniziale dello spray finché non viene rilevato il segnale. Utilizzare l'equazione per lo stato di carica medio mostrata, in cui M è la massa del complesso. Tuttavia, in Dalton, la posizione esatta degli stati di carica dipende dalla proteina.Per evitare la dissociazione del complesso, non riscaldare la fonte di ferro. Spegnere il riscaldatore oppure mantenere la temperatura al di sotto di 40 gradi Celsius. Variare la posizione del capillare, della punta del campione e delle tensioni dell'estratore.Per massimizzare la trasmissione del ferro, un possibile punto di partenza è la tensione del cono, 100 volt per il cono estrattore, un volt e una tensione capillare di 1,5 chilovolt. Verificare la variazione risultante negli spettri. Ottimizzare questi parametri in combinazione con una pressione a flusso nanometrico per migliorare la desolvatazione ed eliminare i componenti residui di acqua e tampone.Aumentare la tensione di polarizzazione in funzione della pressione del gas nella cella di collisione. Le tensioni di polarizzazione tipiche rientrano nell'intervallo da 10 a 100 volt con un flusso di gas trappia da uno a 10 millilitri al minuto. Eseguire questa operazione con attenzione per evitare l'associazione del complesso, regolando le energie di collisione della trappia e del trasferimento.Spesso sono richieste tensioni più elevate, solitamente comprese tra 10 e 30 volt, per la trasmissione di ioni ad alta massa. A questo punto, è importante evitare la dissociazione indotta da collisione del complesso, come mostrato qui. Una volta raggiunto un segnale stabile, si raccomanda di ridurre la pressione del flusso nano e la tensione del capillare ai valori minimi, mantenendo comunque uno spruzzo stabile.Dopo aver acquisito diverse scansioni, procedere all'identificazione dei componenti del complesso mediante spettrometria di massa in tandem. Una volta ottenuto un segnale ottimale e stabile per il complesso proteico, selezionare uno ione precursore e impostare il centro di massa nella larghezza di isolamento. In genere, utilizzare una risoluzione massica bassa pari a 12 e una risoluzione massica alta compresa tra 13 e 15, adottando un ampio intervallo di massa per rilevare i prodotti di dissociazione ad alta massa e bassa carica, quindi ridurre tale intervallo ai valori desiderati per eseguire la ms.Lo spettrometro di massa dissocia il complesso precursorio del ferro aumentando l'energia di collisione, abbreviata CE, e la pressione nella cella di collisione: aumentare gradualmente la CE del trappolamento o del trasferimento a passi di 10-20 volt ed elevare la pressione del gas di collisione da zero a cinque millilitri al minuto. Monitorare le variazioni negli spettri finché non vengono raggiunte le condizioni ottimali di attivazione. Un'elevata energia di attivazione può indurre la dissociazione di una o più subunità dal complesso integro, chiarificando così le affinità di interazione tra le diverse subunità.Selezionare più di una carica per l'analisi MS in spettrometria di massa. Nel caso di componenti sovrapposti, l'acquisizione di un insieme di spettri di tandem MS aiuta a risolvere la serie di cariche delle diverse popolazioni. Inoltre, gli stati di carica più elevati si dissociano più facilmente rispetto agli stati di carica più bassi; sovrapporre quindi lo spettro MS e lo spettro ms.Spettri Ms per convalidare l'isolamento dell'ione precursore scelto. Oltre alla caratterizzazione del complesso integro mediante MS e ms, MS genera sotto-complessi più piccoli in soluzione in condizioni di denaturazione lievi e caratterizza anche questi.L'analisi MS e ms MS di sottocomplessi costituisce la base per definire l'architettura delle subunità del complesso; per una parziale interruzione delle interazioni tra subunità, aggiungere gradualmente solventi organici fino a una concentrazione del 50% oppure modificare il pH della soluzione aggiungendo ammoniaca o acido formico fino a una concentrazione del 4%. Infine, per determinare le masse delle singole subunità che compongono il complesso, è importante acquisire lo spettro in condizioni denaturanti. Questo può essere eseguito utilizzando una zip tip C4 con un rapporto acqua-acetonitrile compreso tra il 25 e il 75% e l'acido formico all'1% come solvente eluente. Tutti i dati raccolti devono essere elaborati e analizzati secondo quanto dettagliato nel protocollo scritto allegato. Prima di caricare il campione del complesso proteico, gli spettrometri di massa vengono calibrati utilizzando ioduro di cesio.La serie di picchi equidistanti evidenziati in rosso si estende su un ampio intervallo, da un rapporto di carica principale di 393 a oltre 10.000. Tali picchi sono attribuiti a cluster salini semplicemente carichi con una composizione generale del complesso contenente cesio. Ulteriori segnali tra i picchi principali indicati in nero sono causati da specie doppiamente e triplamente cariche della serie del complesso di cesio 2+ e del complesso di cesio 3+.Aumentare la pressione nella fase iniziale di vuoto è essenziale per rilevare gli aggregati ad alta massa. L'effetto della pressione sui picchi ad alta massa è qui dimostrato con valori di pressione di 1,2 e 5,3 millibar. Lo spettro di massa a pressione più elevata è mostrato ingrandito in questo caso.Di seguito è riportato un esempio di spettrometria di massa di un complesso di variante lectinica che genera una distribuzione degli stati di carica compresa tra 3000 e 5.000 rapporto massa/carica. Tuttavia, a causa di un'adeguata desalificazione degli ioni, i picchi sono larghi. Aumentando la tensione di polarizzazione da quattro a 15 volt, il che comporta un incremento delle condizioni di accelerazione, si verifica la rimozione di acqua residua e componenti del tampone, ottenendo uno spettro altamente risolto; la massa misurata corrisponde a un complesso pentamerico.Lo stato di carica +15 è stato quindi selezionato per l'analisi in spettrometria di massa tandem. L'aumento dell'energia di collisione provoca il rilascio di un monomero altamente carico centrato a un rapporto massa/carica di 1.664 e di un complesso tetramerico privo di subunità nell'intervallo di rapporto massa/carica compreso tra 5.000 e 8.000. Il complesso della variante della lectina è stato inoltre esaminato in condizioni denaturanti, portando all'associazione del complesso.In questo modo, è possibile determinare la massa esatta delle singole subunità che compongono il complesso. Vi abbiamo appena mostrato come acquisire spettri MS e spettri di tandem MS di ioni ad alta massa. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale preparare correttamente il campione e utilizzare esclusivamente tamponi volatili compatibili con la spettrometria di massa.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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