Name: Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Scopri la quantificazione dei foci γH2AX in risposta alle radiazioni ionizzanti nelle cellule umane. Questo saggio di immunofluorescenza permette di valutare i danni al DNA e i meccanismi di riparazione cellulare.

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Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro.

Preparazione delle cellule <ol><li> Cheratinociti umani (FEP-1811) sono state coltivate in cheratinociti-siero Media gratuito (K-SFM; Invitrogen) integrato con il fattore di crescita epidermico, estratto di ipofisi bovina e 20 mg / ml di gentamicina, a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Una sospensione singola cella è stata preparata da staccare con tripsina-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Le cellule sono state seminate a 8-Tek ben Lab II diapositive microchamber (10.000 cellule / pozzetto) e le diapositive sono state incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Irradiazione <ol><li> Le cellule sono state irradiate su ghiaccio con 2 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada, 20,6 secondi / Gy) </li><li> Controllo irradiato e 2 Gy cellule irradiate sono state incubate per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Immunofluorescenza <ol><li> Media è stata una soffiata e le cellule sono state lavate con 300μl di PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) per bene e sono stati ruotati su un mixer orbitale per 5 minuti. </li><li> Il buffer è stata una soffiata e 100μl di preparati al momento 4% (v / v) è stato aggiunto paraformaldeide in ciascun pozzetto e diapositive sono state incubate a temperatura ambiente per 10 minuti. Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificata </li><li> Le cellule sono state poi lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +). I vetrini sono stati posti in una vaschetta Coplin e ruotata su un mixer orbitale per 5 minuti. Questa fase di lavaggio è stata ripetuta altre due volte. </li><li> Il buffer è stata una soffiata e l'eccesso di PBS è stato gentilmente cancellato. </li><li> Le cellule sono state permeabilizzate con 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) per bene e una incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra. </li><li> Non specifico legame con le proteine ​​è stato bloccato con 100 ml di BSA (1% v / v) per bene e 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente. </li><li> L'eccesso di BSA è stata una soffiata e 100μl di mouse primario monoclonale anti-fosfo-istone H2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA, Millipore), è stato aggiunto in ciascun pozzetto di una incubazione 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di topo diluito 1:500 in BSA 1% ; Invitrogen) per bene per 45 minuti a temperatura ambiente al buio. (Anticorpo diluito è stato tenuto all'oscuro durante tutta la procedura) </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra. Tuttavia, l'esposizione alla luce è stato minimizzato usando pellicola. </li><li> Di contrasto nucleare è stata eseguita con 100ml TOPRO3 (diluito 1:500; Invitrogen) per bene e una incubazione 10 minuti a temperatura ambiente </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) come descritto al punto 10. </li><li> Le camere sono state accuratamente rimosse dalle guide di scorrimento, l'umidità in eccesso è stato cancellato e le diapositive sono stati lasciati asciugare all'aria. </li><li> Una goccia di prolungare ORO anti-sbiadimento soluzione (Invitrogen) è stato aggiunto per bene e le diapositive sono state montate (22x50 millimetri coprioggetto) e il liquido in eccesso lungo i bordi di scorrimento è stata cancellata. </li><li> I vetrini sono stati tenuti al buio per altri 30 minuti a temperatura ambiente prima di sigillare con smalto. </li><li> I vetrini sono stati conservati durante la notte a 4 ° C al buio prima dell'analisi. </li></ol> Microscopia / Analisi <ol><li> Meta confocale Zeiss LSM510 Microscpe utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG) e laser rosso lontano (per TOPRO-3). Tipicamente, un olio 63 x lente ad immersione obiettivo è utilizzato. Le immagini sono acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Un passo di 0,5 micron è stata scelta per minimizzare la perdita di focolai presenti nei diversi piani nei nuclei. Durante l'analisi, i piani individuali sono deconvoluted e sovrapposti per produrre una immagine proiettata al massimo per ridurre al minimo la sovrapposizione di focolai (Top-hat filtro applicato). </li><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per analizzare il numero di focolai. Il programma quantitates il numero di focolai in ogni cella dopo la soglia è stata applicata per escludere sfondo. Le informazioni vengono registrate in un foglio di calcolo Microsoft Excel per ulteriori analisi. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) non trattati in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale. Bar = 10 micron. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale utilizzando 0,5 micron Z-sezionamento (1-9) per garantire che tutti focolai sono stati acquisiti. Le immagini è stata poi impilati per la quantificazione utilizzando Metamorph. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Il γH2AX impilati e le immagini blu erano accatastati per la visualizzazione. Bar = 10 micron.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In seguito all&#39;esposizione a radiazioni ionizzanti (raggi γ), γH2AX forma foci rapidamente e numeri focolai raggiungono un massimo tra 30-60 minuti 2. Pertanto, il nostro 1 ora dalla irradiazione punto di tempo riflette la formazione iniziale DSB. Abbiamo usato la dose di radiazioni clinicamente rilevante di 2 Gy per il nostro esperimento. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato per dosi di radiazioni fino a 4 Gy per il rilevamento di formazione iniziale DSB; sovrapposizione significativa di focolai pre...

<table><tbody><tr><td>Mezzo privo di siero per cheratinociti (K-SFM)</td><td>Mezzi</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Mezzo per cheratinociti integrato con fattore di crescita epidermico ricombinante umano 1-53 (EGF 1-53) ed estratto di ipofisi bovina (BPE).</td></tr><tr><td>Slide con camere Lab Tek II (8 pozzetti)</td><td>Slide con camere</td><td>Nalge Nunc International</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti (22x50 mm)</td><td>Coprioggetti</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>La BSA (1%) viene utilizzata per bloccare eventuali legami non specifici degli anticorpi. Gli anticorpi primari e secondari vengono diluiti nella BSA.</td></tr><tr><td>PBS (senza Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; e Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5% x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Tripsina-EDTA (0,05%) utilizzata per staccare le cellule dai flaconi di coltura.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Il Triton X-100 (0,1%) viene utilizzato per permeabilizzare le cellule.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>La paraformaldeide (4%) viene utilizzata per fissare le cellule.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale murino anti-fosfo istone-H2AX</td><td>Anticorpo primario</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Diluizione dell'anticorpo primario (1:500) in BSA al 1%.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>Anticorpo secondario</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Diluizione dell'anticorpo secondario (1:500) in BSA al 1%.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Colorante per DNA</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Colorante per DNA comunemente usato: cloridrato di 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Può essere utilizzato solo con microscopi dotati del laser di eccitazione appropriato.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Soluzione anti-sfaldamento</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Indice di rifrazione di 1,42 a 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Flacone per coltura cellulare, con tappo ventilato</td><td>Flacone di coltura</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare (150x25 mm)</td><td>Piatto di Petri</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Vasetto Coplin, in vetro</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente per colorazione</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Irradiatore Gammacell 1000 Elite</td><td>Irradiatore a raggi gamma</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocale</td><td>Microscopio confocale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software per l'analisi delle immagini</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione dei γh2ax foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA a doppio filamento (DSB), che sono indotti da processi metabolici sia endogena o da fonti esogene, sono una delle lesioni del DNA più critici in termini di sopravvivenza e la conservazione dell&#39;integrità del genoma. Una risposta presto per l&#39;induzione di DSB è la fosforilazione della variante dell&#39;istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Dopo l&#39;induzione di DSB, H2AX è rapidamente fosforilata dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (Pikk) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Tipicamente, solo poche paia di basi (bp) sono implicati in un DSB, tuttavia, vi è amplificazione del segnale significativo, data l&#39;importanza delle modificazioni della cromatina nella segnalazione del danno al DNA e riparazione. Fosforilazione di H2AX mediato principalmente da ATM si diffonde in aree adiacenti della cromatina, che colpisce circa lo 0,03% del totale dei cellulari H2AX per DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Questo corrisponde alla fosforilazione di circa 2000 molecole H2AX spanning ~ 2 regioni Mbp di cromatina che circonda il sito della DSB e provoca la formazione di discreto γH2AX focolai che possono essere facilmente visualizzati e quantificato mediante microscopia di immunofluorescenza<sup&gt; 2</sup&gt;. La perdita di γH2AX a DSB riflette la riparazione, tuttavia, vi è una certa polemica su ciò che definisce la riparazione completa dei DSB, è stato proposto che la ricongiunzione dei due filamenti di DNA è sufficiente però, è stato anche suggerito che la reintegrazione del stato originale di compattazione della cromatina è necessario<sup&gt; 4-8</sup&gt;. La scomparsa di γH2AX coinvolge almeno in parte, defosforilazione da fosfatasi, fosfatasi 2A e fosfatasi 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Inoltre, la rimozione di γH2AX di redistribuzione che coinvolgono lo scambio degli istoni con H2A.Z è stata implicata<sup&gt; 7,8</sup&gt;. È importante sottolineare che l&#39;analisi quantitativa della γH2AX foci ha portato ad una vasta gamma di applicazioni nella ricerca medica e nucleare. Qui, dimostriamo il metodo più comunemente utilizzato immunofluorescenza per la valutazione del danno al DNA iniziale di rilevazione e quantificazione di γH2AX focolai nei cheratinociti aderente γ-irradiati umano<sup&gt; 9</sup&gt;.

La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l&#39;esposizione delle cellule alle radiazioni.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB), indotte sia da processi metabolici endogeni che da fonti esogene, rappresentano una delle lesioni del DNA più critiche...

Ciao, sono Ian Ma del Laboratorio di Medicina Epigenomica diretto dal Dott. Tom Caris presso il Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Attualmente sto svolgendo il mio dottorato, che si concentra fortemente sugli effetti delle radiazioni su Gamma H due A X, il marcatore molecolare delle rotture a doppio filamento. Oggi illustrerò un esperimento sulla quantificazione di Gamma H due A X in risposta a radiazioni gamma in cellule epiteliali umane.Questo protocollo di immunomarcatura può essere utilizzato per monitorare sia il danno iniziale al DNA che la riparazione del DNA. Questo metodo è inoltre utile per valutare l'efficacia di potenziali composti modificatori delle radiazioni. Ad esempio, i radiosensibilizzatori, che si prevede aumentino il danno al DNA, porteranno a un numero maggiore di gamma H two A X four side, mentre i radioprotettori avranno l'effetto opposto, con un numero inferiore di ForSight rilevati a causa della riduzione delle fratture a doppio filamento del DNA.Ora iniziamo l'esperimento. Le cellule utilizzate in questo esperimento sono citi umani, che vengono preparate in camere portaoggetti con 10.000 cellule posizionate in ciascun pozzetto. I portaoggetti ven

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La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all'interno del nucleo.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo protocollo presenta la preparazione del vetrino e il punteggio automatico del test dei fuochi γ-H2AX sui linfociti del sangue periferico. Per illustrare il metodo e la sensibilità del test, i linfociti isolati sono stati irradiati in vitro. Questo metodo automatizzato di rilevamento del DNA DSB è utile per applicazioni di dosimetria biologica rapida e ad alto rendimento.

Un metodo di punteggio microscopico automatizzato per il test foci γ-H2AX nei linfociti del sangue periferico umano

Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.

Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Scopri la quantificazione dei foci γH2AX in risposta alle radiazioni ionizzanti nelle cellule umane. Questo saggio di immunofluorescenza permette di valutare i danni al DNA e i meccanismi di riparazione cellulare.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

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