Name: In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri la tecnica di micro-patterning per analizzare interazioni proteina-proteina in cellule viventi con alta precisione quantitativa. Questo metodo consente di rilevare interazioni deboli e studiare processi cellulari dinamici.

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Vorremmo ringraziare Quentina Beatty, Università di Linz, in Austria, per il suo gentile aiuto, Katharina Strub, Università di Ginevra, in Svizzera, per la hCD71-GFP costruire, e Daniel Legler, Università di Costanza, in Svizzera, per il GPI-GFP DAF-costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco della scienza (FWF; progetto Y250-B03) e il GEN-AU progetto del Ministero federale austriaco per la Scienza e la ricerca.

Microcontatto stampa: <ol><li> Tagliare campo della micropattern del timbro PDMS con un bisturi </li><li> Lavare il campo contenente il micropattern dal lavaggio con etanolo (100%) e acqua distillata. </li><li> Secco il timbro PDMS con azoto o gas argon. </li><li> Pipettare 50 microlitri BSA-Cy5 soluzione di lavoro (0,67 mg / ml) sul timbro PDMS in modo che l'intero campo micropattern è coperto con una soluzione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campo micropattern da lavaggio con soluzione tampone fosfato (PBS) e acqua distillata. </li><li> Asciugare il PDMS con azoto o gas argon. </li><li> Inserire il timbro PDMS sotto il proprio peso sul mezzo di una resina epossidica rivestite coprioggetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una capsula di Petri. </li><li> Etichetta la posizione del timbro PDMS sul retro del vetrino e nastri il timbro dalla diapositiva con una pinza. </li><li> Bastone di una scheda Secure camera di ibridazione Sigillo il microcontatto stampato campo sul vetrino. L'etichetta consente di localizzare il centro del campo. </li><li> Pipettare 60 microlitri lavoro soluzione streptavidina (50 mg / ml) nella camera di reazione e incubare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campione con 1 ml di PBS con l'aggiunta del tampone in una porta della camera e la rimozione contemporaneamente alla seconda porta con una pompa. </li><li> Pipettare 60 microlitri biotinilato lavoro soluzione di anticorpi (10 mg / ml in PBS integrato con 0,1% di Tween 20; "PBST") nella camera di reazione e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campione con 1 ml PBST e successivamente 1 ml di PBS con l'aggiunta del tampone in una porta della camera e la rimozione di nuovo alla seconda porta con una pompa. </li><li> Conservare le superfici micropatterned in PBS al buio a temperatura ambiente fino a quando le cellule sono pronte per la semina. </li></ol> L'incubazione delle cellule sulla superficie micropatterned: <ol><li> Crescere cellule aderenti al 50% confluenza in un piatto 3 coltura del tessuto cm. </li><li> Staccare cellule che esprimono proteine ​​esca e preda di interesse con l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione e centrifugare 5 min a 1.000 giri al minuto. </li><li> Eliminare il supernatante e sciogliere il pellet di cellule nel mezzo di crescita secondo. </li><li> Centrifugare 5 min a 1.000 giri al minuto. </li><li> Eliminare il supernatante e sciogliere il pellet di cellule nel terreno di coltura appropriato. </li><li> Sostituire la PBS dalla camera di reazione sul vetrino micropatterned da 60 ml di sospensione cellulare. </li><li> Creare una camera umidificata immergendo un tampone sterile in acqua distillata e di metterlo in scatole Petri per evitare che il campione di marcia a secco. </li><li> Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C in un 5% di CO 2 nell'atmosfera sulle superfici micropatterned. </li><li> Prima di analizzare le cellule al microscopio, cambio del mezzo di soluzione salina tamponata Hank s tra cui Ca 2 + e Mg 2 +. </li></ol> Microscopia: <ol><li> Il coprioggetto è posto su un supporto adatto e la morfologia delle cellule è verificata in luce bianca. </li><li> La qualità del-Cy5 BSA modelli è controllato da eccitazione a 647 nm. </li><li> Microdisegni preda di proteine ​​fluorescenti (GFP o YFP) sono registrati a 488 o 514 nm in riflessione interna totale (TIR) ​​eccitazione. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Se c'è interazione tra le proteine ​​bersaglio nelle cellule coltivate su una superficie micropatterned, la preda seguirà la redistribuzione esca. Il micropattern risultante può essere visualizzato dal marchio fluorescenza della proteina preda. È importante sottolineare che il contrasto ottenuto fornisce una misura diretta della forza di interazione (vedi Figura 1). Quindi una semplice valutazione della interazione di due proteine ​​diventa possibile - senza la necessità di elaborare ulteriormente i dati misurati primario. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Riordino della esche vive nella membrana plasmatica delle cellule a diversi punti di forza di interazione. TIR immagini di cellule transfettate con T24 (a) CD71-GFP su anticorpi CD71-, (b) CD4 e YFP citosolica su CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF sulla CD59-anticorpo microbiochips sono mostrati. I dati sono caratteristici di una forte (a), no (b) o l'interazione debole (c). (A) è riprodotto da (Weghuber et al., In stampa), (b) da (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Il video contiene immagini che sono stati forniti da Olympus, tratto dal sito del Laboratorio di Ricerca di visualizzazione, Brown University o riprodotti da (Kim et al., 2003).

Il video che accompagna illustra un metodo per la rilevazione di interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana delle cellule viventi (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in stampa). In linea di principio, qualsiasi TIRF piattaforma basata su microscopia può essere utilizzato come sistema di lettura. Solo quando si vuole un&#39;elevata sensibilità (ad esempio per la rilevazione di singole molecole), microscopi avanzato sarà richiesto. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono particolare attenzione: <ol class="lroman"><li> Conservare Cy5-stock soluzione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo e preparare la BSA-Cy5 soluzione lavoro appena prima della stampa microcontact. </li><li> Fare attenzione a non graffiare la micropattern sul PDMS con la punta della pipetta e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo. </li><li> Mettere il vetrino su un tampone sterile per evitare che si attacchi del vetrino alla capsula di Petri. Una volta che il timbro PDMS ha aderito al vetrino, non muoversi. </li><li> Evitare bolle d&#39;aria nella camera di reazione e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo. </li><li> Non lasciate che il campione secco per più di 2 minuti per evitare la formazione di cristalli di sale. </li><li> Per il distacco delle cellule non usare tripsina come sarà unirà il dominio extracellulare di proteine ​​di membrana finora espresso. Evitare tripsina sarà utile per le proteine ​​con basso tasso di turnover per formare microdisegni subito dopo l&#39;attaccamento delle cellule sulla superficie. </li><li> Controllare il numero di cellule incubate in un microscopio e fare in modo che le cellule non raggiungono più del 30-50% confluenza. Assicurarsi che le cellule vengono rimosse immediatamente eccessivo a causa del fissaggio rapido delle cellule sulla legate agli anticorpi di superficie. </li><li> Solo con diapositive di alta qualità BSA-Cy5 modelli possono essere utilizzati per ulteriori analisi. </li><li> Espressione stabile della proteina fluorescente preda è preferibile a causa di un maggior numero di cellule che possono essere analizzati per scansione. </li><li> Un&#39;adeguata regolazione TIRF è indispensabile per visualizzare modelli a causa di sfondo citosolico. </li></ol> Il micro-patterning tecnica offre numerose opportunità per l&#39;analisi delle interazioni proteina-proteina. In primo luogo, insieme con la quantificazione dei locali, risolta spazialmente interazioni proteina-proteina anche la rilevazione delle interazioni deboli o indiretta è possibile senza lo svantaggio di dare un elevato numero di falsi positivi o negativi. In secondo luogo consente al ricercatore di analizzare le interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana di cellule vive, che è difficile da raggiungere da approcci biochimici come il 2-ibrido schermo. In terzo luogo l&#39;approccio consente la rilevazione di esca-preda interazioni che sono modulati da cambiamenti ambientali come la temperatura, la presenza di diverse proteine ​​o altre molecole o modificazioni post-traduzionali. Così il test permette di modulatori proiezione di una coppia data interazione nel contesto delle cellule vive. Inoltre, riducendo la densità superficiale del ligando cattura o l&#39;uso di leganti monovalente, l&#39;analisi dello stato di riposo diventa possibile. Infine, se adeguatamente le piattaforme di scansione vengono utilizzati, il numero di cellule analizzate è abbastanza alto per soddisfare domande throughput elevato delle aziende farmaceutiche per lo screening di stupefacenti (Ramm, 2005).

in vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, superfici

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Svelare la rete di interazione delle molecole<em&gt; In-vivo</em&gt; È la chiave per la comprensione dei meccanismi che regolano la funzione delle cellule e del metabolismo. Una moltitudine di opzioni metodologiche per affrontare le interazioni molecolari nelle cellule sono state sviluppate, ma la maggior parte di questi metodi soffrono di essere un po &#39;indiretto, e quindi difficilmente quantitativo. Al contrario, alcuni approcci quantitativi di fascia alta sono stati introdotti, che però sono difficili da estendere ad elevato throughput. Per combinare le capacità di throughput elevato con la possibilità di estrarre informazioni quantitative, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo concetto per identificare interazioni proteina-proteina (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di questo sistema che permette di analizzare le interazioni tra un fluoroforo marcata con proteine ​​(&quot;preda&quot;) e una proteina di membrana (&quot;esca&quot;)<em&gt; In-vivo</em&gt;. Le cellule sono placcati su superfici micropatterned funzionalizzati con anticorpi contro il dominio esca exoplasmic. Bait-preda interazioni sono stati analizzati attraverso la redistribuzione della preda fluorescenti. Il metodo è caratterizzato da elevata sensibilità fino al livello di singole molecole, la capacità di rilevare le interazioni deboli, e la capacità di throughput elevato, il che rende applicabile come strumento di screening.

Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l&#39;uso di micro-fantasia superfici. L&#39;approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Svelare la rete di interazione delle molecole in vivo è fondamentale per comprendere i meccanismi che regolano la funzione e il metabolismo cellulari. Una moltitudine di...

È particolarmente importante svelare la rete di interazioni tra molecole nelle cellule viventi per comprendere i meccanismi che regolano il metabolismo e la funzione cellulare. Un numero crescente di metodologie in grado di fornire informazioni qualitative e quantitative rappresenta la forza trainante nel nostro percorso verso una visione olistica della funzione cellulare. Esperimenti di co-immunoprecipitazione, marcatura TAP o cross-linking fotoindotto permettono la purificazione di pre-molecole in vitro.Inoltre, sono stati progettati diversi approcci per l'analisi delle interazioni proteiche nella cellula vivente. Questi includono schermate a due ibridi o saggi di complementazione di proteine fluorescenti. Inoltre, alcuni approcci spettroscopici come FRET o FCS e anche metodi non spettroscopici sono stati sviluppati per affrontare questa questione.Le tecniche sopra menzionate sono state sviluppate per registrare ampie popolazioni cellulari, ma presentano il limite di essere piuttosto indirette e quindi difficilmente quantitative. Al contrario, sono stati introdotti alcuni approcci quantitativi avanzati. Tuttavia, estendere le capacità ad alto rendimento è difficile da combinare con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo concetto per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina. La tecnica di microimpaginazione qui riportata è un'illustrazione schematica di griglie di microimpaginazione SA di BSA Sci cinque stampate su coprioggetti di vetro funzionalizzati e gli spazi intermedi riempiti con streptavidina, seguiti da ligandi biotinilati. Nella maggior parte dei casi, anticorpi contro la membrana.Esca proteica in cellule coltivate su chip microbioma di questo tipo. L'esca sarà disposta nella membrana plasmatica secondo il micro-modello dell'anticorpo. Le interazioni con una seconda proteina bersaglio marcata con un fluorocromo vengono analizzate misurando il grado di co-patterning utilizzando un timbro in PDMS con un master in silicio contenente un array di quadrati con dimensione e profondità definite.I tre micrometri sono prodotti da un gel e tagliati. I timbri vengono risciacquati con etanolo al 100% e acqua bidistillata doppia e asciugati con azoto in precedenza. Vengono incubati con 0,67 milligrammi per millilitro di sci-fi.Soluzione di BSA marcata per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione; nel frattempo, le lamelle di vetro modificate con epossidico vengono pulite nello stesso modo. Allo stesso modo, dopo l'inchiostro, i timbri vengono lavati con PBS e acqua. Per il trasferimento di BSA sci cinque.Un timbro viene essiccato con azoto e immediatamente dopo viene posizionato sotto il proprio peso sotto un'ampolla di vetro per 30 minuti. La posizione del campo del microdisegno viene segnata sul retro dell'ampolla. Dopo aver rimosso i timbri, le ampolle vengono sigillate con maschere di silicone adesivo.Le camere vengono caricate con una soluzione di Streptavidina a 50 microgrammi per millilitro, incubata per un'ora e risciacquata successivamente con un millilitro di PBS. Successivamente, i modelli di streptavidina vengono incubati con un'ora con un anticorpo biotinilato a 10 microgrammi per millilitro e, dopo il lavaggio con PBS, le cellule vengono caricate nella camera. Quando le cellule si sono attaccate alla superficie, il campione è pronto per le misurazioni.L'unico requisito per la lettura è un microscopio a fluorescenza in grado di illuminare il campione in configurazione di riflessione totale interna. Tali sistemi sono disponibili in commercio da diversi fornitori e negli ultimi anni sono diventati facili da utilizzare per l'utente. Il nostro sistema di rilevamento è installato su un microscopio a fluorescenza in illuminazione episcopica.I laser a ioni di argon e kripton vengono utilizzati per l'eccitazione selettiva della fluorescenza dei campioni fluorofori impiegati. I campioni vengono illuminati in una configurazione basata sull'obiettivo in riflessione totale interna, mediante un obiettivo ad immersione in olio con ingrandimento 100x e alta apertura numerica. Dopo un opportuno filtraggio tramite set di filtri standard, la fluorescenza viene proiettata su una camera CCD a illuminazione posteriore. L'acquisizione avviene in modalità time delay and integration, che consente la scansione di ampie aree campione. A tale scopo, i campioni vengono spostati mediante uno stage motorizzato XY sincronizzato allo spostamento della linea della camera.Il fascio laser riflesso all'indietro viene immagine su un fotodiodo a due segmenti e il segnale differenziale viene utilizzato per controllare un piezoelettrico Z per un rapido rifocalizzazione. Il lettore è dotato di un sistema automatico di mantenimento del fuoco operativo durante il processo di scansione, con una scansione a 488 nanometri per l'eccitazione selettiva della GFP e una seconda scansione a 647 nanometri per l'eccitazione selettiva della PS Five. Per l'analisi dei dati, utilizziamo un programma di calcolo del contrasto scritto in MATLAB basato sull'intensità di fluorescenza all'interno e all'esterno della regione dell'anticorpo catturato.Il livello di contrasto e quindi il grado di interazione proteica vengono analizzati per un'analisi rapida di un elevato numero di cellule. È possibile utilizzare anche software automatizzati disponibili in commercio. Ad esempio, il software di imaging scan R offerto da Olympus è stato testato con successo per la valutazione del contrasto in esperimenti di microimpaginazione.Analizziamo l'interazione ben nota tra CD4 e LCK nelle proteine della segnalazione precoce dei linfociti T, come mostrato qui. LCK fluorescente si ridistribuisce chiaramente nelle regioni rivestite con anticorpi anti-CD4. L'interruzione della struttura a chela di zinco, che rappresenta il principale sito di interazione tra queste due proteine, mediante l'aggiunta di un chelante dello zinco riduce il contrasto dei micro-modelli di LCK.In sintesi, i principali vantaggi della tecnica di micro-patterning sono i seguenti: quantificazione di interazioni proteiche locali con risoluzione spaziale. Inoltre, il rilevamento di interazioni deboli anche nella membrana plasmatica di cellule vive, il rilevamento di interazioni tra esca e preda modulate, l'analisi dello stato di riposo e l'applicabilità dell'approccio per analisi ad alto rendimento.

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