In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

È particolarmente importante svelare la rete di interazioni tra molecole nelle cellule viventi per comprendere i meccanismi che regolano il metabolismo e la funzione cellulare. Un numero crescente di metodologie in grado di fornire informazioni qualitative e quantitative rappresenta la forza trainante nel nostro percorso verso una visione olistica della funzione cellulare. Esperimenti di co-immunoprecipitazione, marcatura TAP o cross-linking fotoindotto permettono la purificazione di pre-molecole in vitro.

Inoltre, sono stati progettati diversi approcci per l'analisi delle interazioni proteiche nella cellula vivente. Questi includono schermate a due ibridi o saggi di complementazione di proteine fluorescenti. Inoltre, alcuni approcci spettroscopici come FRET o FCS e anche metodi non spettroscopici sono stati sviluppati per affrontare questa questione.

Le tecniche sopra menzionate sono state sviluppate per registrare ampie popolazioni cellulari, ma presentano il limite di essere piuttosto indirette e quindi difficilmente quantitative. Al contrario, sono stati introdotti alcuni approcci quantitativi avanzati. Tuttavia, estendere le capacità ad alto rendimento è difficile da combinare con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo concetto per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina. La tecnica di microimpaginazione qui riportata è un'illustrazione schematica di griglie di microimpaginazione SA di BSA Sci cinque stampate su coprioggetti di vetro funzionalizzati e gli spazi intermedi riempiti con streptavidina, seguiti da ligandi biotinilati. Nella maggior parte dei casi, anticorpi contro la membrana.

Esca proteica in cellule coltivate su chip microbioma di questo tipo. L'esca sarà disposta nella membrana plasmatica secondo il micro-modello dell'anticorpo. Le interazioni con una seconda proteina bersaglio marcata con un fluorocromo vengono analizzate misurando il grado di co-patterning utilizzando un timbro in PDMS con un master in silicio contenente un array di quadrati con dimensione e profondità definite.

I tre micrometri sono prodotti da un gel e tagliati. I timbri vengono risciacquati con etanolo al 100% e acqua bidistillata doppia e asciugati con azoto in precedenza. Vengono incubati con 0,67 milligrammi per millilitro di sci-fi.

Soluzione di BSA marcata per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione; nel frattempo, le lamelle di vetro modificate con epossidico vengono pulite nello stesso modo. Allo stesso modo, dopo l'inchiostro, i timbri vengono lavati con PBS e acqua. Per il trasferimento di BSA sci cinque.

Un timbro viene essiccato con azoto e immediatamente dopo viene posizionato sotto il proprio peso sotto un'ampolla di vetro per 30 minuti. La posizione del campo del microdisegno viene segnata sul retro dell'ampolla. Dopo aver rimosso i timbri, le ampolle vengono sigillate con maschere di silicone adesivo.

Le camere vengono caricate con una soluzione di Streptavidina a 50 microgrammi per millilitro, incubata per un'ora e risciacquata successivamente con un millilitro di PBS. Successivamente, i modelli di streptavidina vengono incubati con un'ora con un anticorpo biotinilato a 10 microgrammi per millilitro e, dopo il lavaggio con PBS, le cellule vengono caricate nella camera. Quando le cellule si sono attaccate alla superficie, il campione è pronto per le misurazioni.

L'unico requisito per la lettura è un microscopio a fluorescenza in grado di illuminare il campione in configurazione di riflessione totale interna. Tali sistemi sono disponibili in commercio da diversi fornitori e negli ultimi anni sono diventati facili da utilizzare per l'utente. Il nostro sistema di rilevamento è installato su un microscopio a fluorescenza in illuminazione episcopica.

I laser a ioni di argon e kripton vengono utilizzati per l'eccitazione selettiva della fluorescenza dei campioni fluorofori impiegati. I campioni vengono illuminati in una configurazione basata sull'obiettivo in riflessione totale interna, mediante un obiettivo ad immersione in olio con ingrandimento 100x e alta apertura numerica. Dopo un opportuno filtraggio tramite set di filtri standard, la fluorescenza viene proiettata su una camera CCD a illuminazione posteriore. L'acquisizione avviene in modalità time delay and integration, che consente la scansione di ampie aree campione. A tale scopo, i campioni vengono spostati mediante uno stage motorizzato XY sincronizzato allo spostamento della linea della camera.

Il fascio laser riflesso all'indietro viene immagine su un fotodiodo a due segmenti e il segnale differenziale viene utilizzato per controllare un piezoelettrico Z per un rapido rifocalizzazione. Il lettore è dotato di un sistema automatico di mantenimento del fuoco operativo durante il processo di scansione, con una scansione a 488 nanometri per l'eccitazione selettiva della GFP e una seconda scansione a 647 nanometri per l'eccitazione selettiva della PS Five. Per l'analisi dei dati, utilizziamo un programma di calcolo del contrasto scritto in MATLAB basato sull'intensità di fluorescenza all'interno e all'esterno della regione dell'anticorpo catturato.

Il livello di contrasto e quindi il grado di interazione proteica vengono analizzati per un'analisi rapida di un elevato numero di cellule. È possibile utilizzare anche software automatizzati disponibili in commercio. Ad esempio, il software di imaging scan R offerto da Olympus è stato testato con successo per la valutazione del contrasto in esperimenti di microimpaginazione.

Analizziamo l'interazione ben nota tra CD4 e LCK nelle proteine della segnalazione precoce dei linfociti T, come mostrato qui. LCK fluorescente si ridistribuisce chiaramente nelle regioni rivestite con anticorpi anti-CD4. L'interruzione della struttura a chela di zinco, che rappresenta il principale sito di interazione tra queste due proteine, mediante l'aggiunta di un chelante dello zinco riduce il contrasto dei micro-modelli di LCK.

In sintesi, i principali vantaggi della tecnica di micro-patterning sono i seguenti: quantificazione di interazioni proteiche locali con risoluzione spaziale. Inoltre, il rilevamento di interazioni deboli anche nella membrana plasmatica di cellule vive, il rilevamento di interazioni tra esca e preda modulate, l'analisi dello stato di riposo e l'applicabilità dell'approccio per analisi ad alto rendimento.