Sincronizzazione dei nematodi: un metodo per ottenere popolazioni di vermi in identiche fasi di sviluppo

0 visualizzazioni3:43 min • April 30th, 2023

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-Inizia posizionando i vermi autofertilizzanti nel loro ultimo stadio larvale su piastre seminate con una fonte di cibo batterico. Lascia che le larve si sviluppino in adulti maturi fino a quando non c'è un'abbondanza di uova all'interno dei vermi e deposte sui piatti. Lavare i piatti con il tampone per raccogliere le uova e i vermi.

Quindi, sostituire il tampone con una soluzione di candeggina che dissolve i vermi adulti. Protetti dal guscio dell'uovo, gli embrioni sopravviveranno a questo trattamento, anche se si troveranno in diversi stadi di sviluppo. Quindi sostituisci la candeggina con il tampone e lascia che gli embrioni si sviluppino. Quando le larve si schiudono dai loro gusci d'uovo in assenza di cibo, lo sviluppo si fermerà al primo stadio larvale.

Trasferisci le larve nei piatti con il cibo per riprendere lo sviluppo. Ciò stimolerà la progressione sincrona attraverso i restanti stadi larvali.

Quando i vermi raggiungono l'ultimo stadio larvale, spostali nei piatti con cibo e FUdR, un inibitore della sintesi del DNA che impedisce la produzione di prole. Il continuo sviluppo in presenza di FUdR produce una popolazione di vermi adulti sterili. In questo esperimento, sincronizzeremo una popolazione del nematode C. elegans.

-Per iniziare, trasferire le larve L4 del background genetico desiderato su un prato di Escherichia coli appena seminato su terreni di crescita di nematodi o piastre NGM. Utilizzare almeno due piastre da 100 millimetri o tre da 60 millimetri per ogni ceppo.

Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata per tre o quattro giorni o fino a quando le piastre non sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi. Lavare le uova e i vermi dalle piastre usando circa sei millilitri di tampone M9 per piastra da 100 millimetri di nematodi. Utilizzando pipette di vetro Pasteur, trasferire le uova e i vermi in singole provette da centrifuga da 15 millilitri per ogni ceppo. Centrifugare questi tubetti per tre minuti a 6.180 g.

Dopo la centrifugazione, aspirare il tampone M9 trattenendo solo l'animale e il pellet di uova. Aggiungere tre o quattro millilitri di soluzione di candeggina a ciascun tubo e agitare a intermittenza per sei minuti.

Quindi aggiungere il tampone M9 per riempire ogni provetta e centrifugare a 6.180 g per un minuto. Aspirare il surnatante e ripetere questo lavaggio con M9 tre volte.

Dopo il lavaggio, spostare la pallina d'uovo in un tubo fresco da 15 millilitri contenente circa nove millilitri di tampone M9. Sincronizza i vermi appena nati nuttandoli a 20 gradi Celsius per 16-48 ore.

Dopo aver fatto girare questi tubi a 6.180 g per 1,5 minuti, mettere gli animali L1 sincronizzati su un prato di OP50 appena seminato su piastre NGM individuali. Mantenere le piastre a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali non raggiungono lo stadio larvale L4 dopo circa 42 ore. A questo punto, usa un plettro di platino per spostare le larve L4 su piastre NGM seminate OP50 contenenti 0,5 milligrammi per millilitro di FUdR per evitare che producano progenie.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026