drosofila Saggio di scavo e tunneling: un metodo per valutare l'ipossia tissutale nelle larve di mosca

- Per allestire la gabbia di raccolta degli embrioni, utilizzare piastre di agar per succo d'uva integrate con pasta di lievito fresco e posizionare le piastre su gabbie contenenti mosche Drosophila maschio e femmina del genotipo appropriato. L'odore del lievito e del succo d'uva è attraente e favorisce la deposizione delle uova da parte delle femmine. Lasciare deporre le uova per un periodo di tempo. Quindi rimuovere gli adulti e incubare le piastre embrionali per 24 ore per ottenere le larve di primo stadio. Quindi trasferisci delicatamente alcune singole larve dalla piastra del succo d'uva su una piastra di prova di solo agar dove è stato ritagliato un foro nell'agar al centro della piastra e riempito con pasta di lievito.

Le giovani larve devono nutrirsi per aumentare il peso corporeo per svilupparsi, quindi scavano nella fonte di cibo, la pasta di lievito. Man mano che si sviluppano, le larve entrano in una fase di vagabondaggio e si allontanano dal cibo per cercare un sito per l'impupamento. Per valutare l'ipossia, esaminare i modelli di tunneling che le larve formano nel substrato. La mancanza o l'insufficienza del tunneling è un segno di privazione di ossigeno. Nel protocollo di esempio, vedremo come impostare il saggio di scavo e tunneling.

- Impostare gli incroci genetici di controllo e sperimentali nei piatti per la deposizione delle uova come descritto nel protocollo di testo. Tieni le mosche al buio per almeno due giorni prima di iniziare la raccolta delle uova a tempo. Per la raccolta delle uova a tempo, trasferire gli adulti su nuovi piatti di agar d'uva decorati con una fresca spalmatura di pasta di lievito all'inizio della giornata e lasciare che gli adulti depongano le uova sui piatti per quattro ore. Dopo quattro ore, trasferire gli adulti su piastre di agar d'uva fresca.

Successivamente, incubare le piastre di raccolta di quattro ore durante la notte a 25 gradi Celsius. Entro il pomeriggio successivo, la maggior parte delle larve si sarà schiusa. Pianifica di averne almeno 50 per ogni gruppo sperimentale.

Per una singola esecuzione del saggio, preparare almeno cinque piastre di saggio per gruppo sperimentale. Aggiungere 16 grammi di agar agar in 700 millilitri di acqua deionizzata riscaldando. Preparare 17,5 millilitri di Nipagen in etanolo al 95%. Riscaldare la soluzione di agar fino a quando non è quasi completamente sciolta. Quindi aggiungere la soluzione di Nipagen alla soluzione di agar e scaldare fino a quando l'agar non si dissolve completamente. Raffreddare brevemente la soluzione di agar, quindi caricare piastre da 10 centimetri con 15 millilitri di soluzione di agar. Una volta che l'agar si è gelificato, metti i coperchi sui piatti e lasciali asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte.

L'agar stagionato deve essere sodo al tatto e resistere allo sbriciolamento quando i pezzi vengono tagliati da esso. Una volta che l'agar si è indurito, usa una trivella di sughero da 1,5 centimetri per praticare un foro centrale nel gel di agar in ogni piastra. Quindi riempire accuratamente i buchi con pasta di lievito fresco.

Per trasferire le larve sulla piastra di analisi, è necessario creare uno strumento semplice. Piega una curva nella punta di una microspatola di plastica e immergi la punta nella pasta di lievito per renderla adesiva alle larve. Ora raccogli le larve del primo stadio individualmente e posizionale sulla piastra di agar vicino al cumulo di cibo. Per ogni gruppo sperimentale, preparare almeno cinque piastre ciascuna con 10 larve.

Per garantire la riproducibilità tra le repliche dei saggi, è fondamentale che solo 10 larve siano posizionate su ciascuna piastra di analisi. Assicurarsi di controllare attentamente la piastra del saggio per determinare che una e una sola larva venga trasferita ogni volta che si consegna una larva con la punta della microspatola.

Una volta caricato il piatto, etichettarlo, coprirlo, quindi posizionarlo al buio con il coperchio rivolto verso l'alto a temperatura ambiente. Esamina ogni piastra ogni giorno fino a quando tutte le larve sono morte o impupate. Di seguito sono riportati alcuni esempi di piastre per un ceppo di tipo selvatico dal secondo all'ottavo giorno del saggio. Il secondo giorno, le larve vengono sepolte nel cibo e non si verifica alcun tunneling. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra il quinto e l'ottavo giorno, quando le larve smettono di vagare e si impupano nei loro tunnel.

Trasferisci con cura le pupe con un ago da pesca piegato su un piatto d'uva e, se lo desideri, conta quante pupe racchiudono. Prendi nota della formazione delle pupe e valuta le pupe per anomalie.