Name: EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Scopri il metodo esiRNA per lo screening RNAi ad alto rendimento in cellule di mammifero. Questa tecnica consente di identificare geni coinvolti nella divisione cellulare con elevata specificità e efficienza.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Buchholz e il Sigma-Aldrich RNAi-team per la discussione. Vorremmo ringraziare la Max Planck Society e il Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] per il supporto. MISSION ® è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP

1. Di alta qualità MISSIONE esiRNA librerie <ol><li> Per ogni gene di interesse della regione di destinazione più sensibili e specifici per la RNAi viene scelto utilizzando l&#39;algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Punteggi DEQOR il potenziale silenziamento di tutti possibili 21 nucleotidi siRNA a lungo in un obiettivo-mRNA in base a state-of-the-art design vincoli 4. Inoltre, ogni siRNA potenziale è analizzato per un possibile cross-reattività con altri geni eseguendo una ricerca BLAST contro il trascrittoma dell&#39;organismo studiato. Il programma prevede quindi una analisi della qualità complessiva e cross-silenziamento capacità del esiRNA potenziale (300-600 lunghezza bp). </li><li> La regione scelta del target-gene cDNA viene amplificato mediante PCR utilizzando primers gene-specifici affiancato da batteriofagi RNA-polimerasi-promotore sequenze. </li><li> Ogni prodotto di PCR utilizzata per la produzione MISSIONE esiRNA è verificata l&#39;identità mediante sequenziamento e l&#39;analisi di purezza, Pinza Labchip. </li><li> Long double-stranded RNA trascritto dal prodotto PCR da RNA polimerasi, seguita da una ricottura dei fili trascritte. </li><li> esiRNAs sono preparati da limitate digestione enzimatica della long double-stranded RNA utilizzando RNaseIII seguita dalla purificazione tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando Q-sefarosio colonne di rotazione. </li><li> esiRNAs sono precipitati e risospese in tampone TE. Il rendimento si misura con assorbimento UV-misure e la concentrazione è regolata sciogliendo in un volume adeguato di tampone TE. La qualità complessiva del prodotto finale è controllato da analisi Pinza Labchip. </li></ol> 2. La scelta di una linea cellulare e ottimizzare la trasfezione per lo screening <ol><li> Quantità titolare di esiRNA (uso Eg5 come positivi e Renilla-luciferasi come controllo negativo) e quantità crescenti di reagenti di trasfezione in 384 pozzetti, aggiungere le cellule e incubare per 48 ore. Eg5 è una proteina motore chinesina necessari per l&#39;assemblaggio del fuso bipolare e l&#39;esaurimento porta ad un arresto mitotico. Ripetere questa procedura per i reagenti di trasfezione diverse linee cellulari. Qui, usiamo le cellule HeLa in coltura seguendo le procedure standard e oligofectamine (Invitrogen) come reagente di trasfezione. </li><li> Per la scelta delle condizioni ottimali di transfezione contare le cellule transfettate con Eg5 esiRNAs che mostrano un arresto mitotico (forma rotonda) e il numero totale di cellule trasfettate con Renilla-luciferasi (RLUC) esiRNA al microscopio ottico. Scegli la condizione con il minor tossicità per RLUC e il fenotipo più pronunciata per Eg5. Un metodo alternativo per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di trasfezione stabile coinvolge una linea di cellule che esprimono EGFP (o un altro gene reporter adatto) sotto il controllo di un promotore costitutivo attivo. Dopo la trasfezione di un esiRNA contro EGFP (o un altro gene reporter) e RLUC (o altro idoneo esiRNA controllo negativo) misura knock-down efficacia e la tossicità ad esempio con l&#39;ordinamento delle cellule assistita fluorescenza (FACS). Assicurarsi che il esiRNA utilizzato per EGFP è perfettamente complementare al target-mRNA. </li></ol> 3. Impostazione della schermata principale 5,6 <ol><li> Ottimizzare la precisione di pipettaggio per tutti i componenti utilizzati in una stazione di pipettamento automatizzati (ad esempio l&#39;Acquario, Tecan e WellMate, Matrix). Poiché i parametri pipettaggio cambiano a seconda del tipo di tipo di soluzione, il volume e la piastra di questa ottimizzazione deve essere ripetuta per ogni fase separatamente. Se possibile, la stazione di pipettamento deve essere posto sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Tutti i componenti utilizzati devono essere disinfettati prima di utilizzare sia in autoclave, se applicabile a spruzzo o con il 75% di etanolo. Ottimizzare i protocolli di lavaggio in modo che la contaminazione incrociata da pozzetto a pozzetto è esclusa. Dettagli per l&#39;ottimizzazione del pipettaggio automatizzato non si può dare per vincoli di spazio e dipendono in gran parte dalla stazione di pipettamento utilizzati. Per maggiori informazioni fare riferimento al protocollo produce. </li><li> Trasfezione delle cellule in formato da 384 pozzetti utilizzando le condizioni ottimizzate dall&#39;alto con esiRNAs per Eg5 e RLUC. Utilizzare uno schema alternato per Eg5 e RLUC esiRNA copre l&#39;intera piastra. </li><li> Dopo incubazione per 48 ore fissare le cellule con etanolo freddo al 100%, reidratare in PBS per 15 minuti, macchia per 25 minuti in PBS contenente 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml RNasi A (Qiagen). Infine lavare con PBS e conservare a 4 ° C. </li><li> Misurare l&#39;intensità di fluorescenza DAPI-ad esempio con microscopia su un sistema Olympus ScanR. Genera un istogramma tracciando intensità DAPI contro numero di cellulare e valutare la distribuzione del ciclo cellulare calcolando la percentuale di cellule con il DNA contenuto 2N per G1-fase; &lt;2N&gt; 4N per la fase S; 4N per G2/M-phase e &gt; 4N per aneuploidie / poliploidia. </li><li> Valutare l&#39;omogeneità dei risultati sopra la piastra. Ulteriore ottimizzazione è necessario se i risultati differiscono significativamente da escludere effe posizionects. Un problema comune quando si usano più pozzetti evaporazione è maggiore nei pozzi bordo durante il tempo di incubazione. Questo porta a diverse condizioni sperimentali in pozzi diversi, che si traduce spesso alla piastra posizioni effetti specifici. Per questo motivo, si consiglia di lasciare tutti i pozzi vuoti a bordo di uno schermo. Per minimizzare ulteriormente l&#39;evaporazione assicurarsi che le incubatrici sono mantenuti a umidità elevata. Abbiamo anche abitualmente utilizzano barriere evaporazione come nastro di tenuta Corning traspirante che bloccano l&#39;evaporazione. Anche altre risorse per gli effetti di posizione devono essere presi in considerazione, ad esempio, variazioni tecniche del sistema di lettura (microscopio, lettore di piastre, ecc) o variazioni di manipolazione dei liquidi (gradienti, disomogeneità delle soluzioni, ecc.) </li><li> Le differenze statistiche tra controlli positivi e negativi di fornire una misura della significatività del test impiegato. Una grande differenza tra controllo negativo (o rumore di fondo; mock-controllo) e il campione deve essere stabilito prima di iniziare la proiezione vera e propria. Una buona misura per la significatività statistica è la Z-fattore. Lo Z-fattore è calcolato secondo la formula: Z = 1 - (3 SD [campione] + 3 SD [finta]) * (| Av [campione] - Av [finta] |) -1, con SD: deviazione standard; Av: media. Un fattore di Z-1&gt; Z&gt; 0,5 indica una separazione statisticamente significativo dei controlli negativi (e rumore) dai controlli positivi 7. </li></ol> 4. Schermo primario <ol><li> Preparare 384 e piastre di coltura di tessuto per la transfezione di esiRNAs utilizzando le condizioni ottimizzate dall&#39;alto. Qui, usiamo esiRNA 15ng per ben sciolto in tampone 5μl TE. Almeno otto posizioni di controllo per piastra deve essere caricata con opportuni controlli positivi e negativi per il processo biologico studiato (qui: Eg5 e RLUC). Per evitare effetti la posizione del bordo pozzi vengono caricati con tampone TE 5μl solo. </li><li> Aggiungi 5μl OptiMEM (Invitrogen) contenente Oligofectamine 0.2μl per bene, mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi sospensione cellulare sulla miscela di trasfezione (qui: 40μl di una sospensione di cellule HeLa a 25 cellule / concentrazione microlitri, pari a 1000 cellule per pozzetto) e incubare per 72 ore. </li><li> Misura del DNA contenuto in un microscopio automatico (Olympus ScanR, vedi sopra). Valutare con Z-score statistiche per la selezione hit: Z-score vengono calcolati per tutti esiRNAs esempio utilizzando il segnale per il controllo negativo come riferimento. Nota, la Z-score non è la stessa della Z-fattore. Z-score fornisce una misura statistica per la significatività dei valori del campione rispetto ad un (finto) di controllo. Si è calcolato secondo la formula: Z = (valore [Sample] - media [finta]) * deviazione standard [finta] -1. Per la selezione ha colpito una soglia deve essere applicato. Tipicamente, un criterio di significato come: 2 &lt;Z &lt;-2 viene utilizzato, ma a seconda della qualità del set di dati, il processo biologico studiato o semplicemente la portata dello schermo, soglie differenti possono essere applicabili. Accanto alla abbastanza facile Z-score statistiche anche più elaborati metodi di valutazione matematico può essere utilizzato (dentro una prima volta nel vasto campo della valutazione statistica dei dati di screening può essere trovato a Malo et al. 8). </li></ol> 5. Schermo secondario e validazione colpito <ol><li> Uno schermo secondario segue lo schermo principale per eliminare i falsi positivi a causa di errori sperimentali o off-target effetti. Per i colpi selezionato la stessa procedura utilizzata nella schermata principale dovrebbe essere ripetuto per un maggior numero di repliche (3-5) per consentire una migliore valutazione statistica. </li><li> Per colpisce verificato un esiRNA secondaria non sovrapposti (o un altro non sovrapposti innescare silenziamento) rispetto agli obiettivi individuati nelle schermate iniziali dovrebbero essere usati. La stessa analisi e lettura deve essere applicato come per lo schermo principale. </li><li> In definitiva i geni selezionati possono essere convalidati da cross-specie di soccorso RNAi 9. Quindi un cromosoma batterico artificiale (BAC) che codifica per esempio il ortholog topo del gene è trasfettate stabilmente nelle cellule. BAC-costruisce conservare un gene nel suo contesto genomica e consentire una espressione quasi-fisiologica. RNAi contro il gene endogeno umano lascerà l&#39;espressione del transgene inalterato topo che salva il RNAi-fenotipo. RNAi-rescue fornisce il gold-standard per la verifica dei fenotipi RNAi ad oggi disponibili. </li><li> Infine, i candidati validati sono studiate in modo più dettagliato alla fine di ricavare comprensione meccanicistica. In molti casi RNAi può essere utilizzato in questi esperimenti, ad esempio in secondaria, i test più elaborati. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano rapporti finanziari con gli enti commerciali che potrebbe avere un interesse per il lavoro presentato.

RNA interference è diventata una tecnica standard per studiare la perdita di funzione fenotipi. Su larga scala collezioni di RNAi-mediatori sono disponibili da diversi fornitori e fornisce un metodo facile, conveniente e rapido per silenziamento genico. Ciò ha aperto la porta per lo screening sistematico per attori chiave in molti processi biologici che permette un genoma scala punto di vista su una vasta gamma di diverse specie e tipi di cellule. Alto tasso di falsi positivi e falsi negativi sono una sfida comune a schermi RNAi. Per risolvere questo problema, notevoli sforzi sono stati investiti per migliorare l&#39;efficacia e, in particolare, la specificità del silenziamento trigger. Una scoperta importante fu che un pool di diversi siRNA targeting la trascrizione stessa migliora notevolmente la specificità del bersaglio. Perché una piscina molto complessa di diversi siRNA è prodotto dalla endoribonuclease, esiRNAs sono alti trigger specificità del bersaglio, riducendo il tasso di falsi positivi nelle schermate RNAi. esiRNAs hanno anche dimostrato di raggiungere atterramenti efficiente, riducendo anche il tasso di falsi negativi. Poiché gli schermi RNAi sono tecnicamente impegnativi, che probabilmente rimarrà difficile da eseguire di routine per qualche tempo. Tuttavia, come reagenti e strumenti di laboratori di ottenere una migliore e più condividere la loro esperienza, l&#39;uso di schermi RNAi in biologia moderna sono ritenuti aumentare in futuro.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Per ulteriori informazioni contattare: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante traspirante</td><td>Corning</td><td>Nastro sigillante traspirante, sterile (Prodotto n. 3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Etanolo&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 gradi (assoluto), per biologia molecolare</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Soluzione salina tamponata al fosfato&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Reagente Bio, concentrato 10x, adatto per colture cellulari, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">Cloridrato di 4&amp;#8242;,6-diamidino-2-fenilindolo&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Polvere, reagente Bio, adatto per colture cellulari, &amp;gt;98% (HPLC e TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonucleasi A dal pancreas bovino&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Per biologia molecolare, &amp;#8805;70 unità Kunitz/mg di proteina, polvere liofilizzata</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Soluzione tampone Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100x, per biologia molecolare</td></tr></tbody></table>

esirna missione per lo screening rnai in cellule di mammifero

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Interferenza dell&#39;RNA (RNAi) è un meccanismo cellulare di base per il controllo dell&#39;espressione genica. RNAi è indotta da brevi double-stranded RNA conosciuta anche come piccoli RNA interferenti (siRNA). Il corto double-stranded RNA provengono da più precursori a doppio filamento per l&#39;attività di Dicer, una proteina della famiglia delle endonucleasi RNasi III. I frammenti risultanti sono i componenti del silenziamento dell&#39;RNA indotta complesso (RISC), orientandola verso l&#39;mRNA bersaglio affini. RISC si unirà l&#39;mRNA bersaglio riducendo così l&#39;espressione della proteina codificata 1,2,3. RNAi è diventato un metodo potente ed ampiamente utilizzato sperimentale per la perdita degli studi di funzione del gene in cellule di mammifero utilizzando piccoli RNA interferenti. Attualmente due metodi principali sono disponibili per la produzione di piccoli RNA interferenti. Un metodo comporta sintesi chimica, mentre un metodo alternativo impiega scissione endonucleolytic di target specifici long double-stranded RNA da RNase III in vitro. In tal modo, un pool eterogeneo di siRNA oligonucleotidi come viene prodotto, che è anche conosciuto come endoribonuclease preparata siRNA o esiRNA. Un confronto di efficacia di siRNA chimicamente derivati ​​e esiRNAs mostra che entrambi i trigger sono potenti in target-silenziamento genico. Differenze possono però essere visti quando si confrontano specificità. Molti siRNA solo per sintesi chimica di produrre importanti effetti off-target, mentre la miscela complessa inerente esiRNAs porta ad una più specifica knockdown 10. In questo studio, presentiamo il progetto di librerie MISSIONE genoma scala esiRNA e il suo utilizzo per lo screening RNAi esemplificato da un DNA contenuto dello schermo per l&#39;identificazione di geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Mostriamo come ottimizzare il protocollo di trasfezione e il test per lo screening in un throughput elevato. Abbiamo anche dimostrare come grandi insiemi di dati possono essere valutati statisticamente e presenti metodi per convalidare colpi primaria. Infine, diamo potenziali punti di partenza per ulteriori caratterizzazioni funzionali di visite convalidato.

Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un meccanismo cellulare fondamentale per il controllo dell'espressione genica. L'RNAi è indotta da brevi RNA a doppio filamento, noti anche come...

La selezione di geni associati al ciclo cellulare mediante RNAi inizia con la scelta di una tecnologia di silenziamento genico appropriata, come Mission.Easy. Le librerie di RNAi di Sigma-Aldrich sfruttano l'elevata efficienza e specificità degli siRNA preparati con ribonucleasi endogena. Gli RNAi Easy sono pool complessi di singoli siRNA, ottenuti mediante digestione enzimatica di RNA a doppio filamento lungo, complementare all'RNA messaggero bersaglio. Il raggruppamento di siRNA diretti verso lo stesso trascritto aumenta la specificità e previene la laboriosa ricerca di singoli siRNA efficienti e specifici.Questo rende l'RNA interferente particolarmente adatto a schermate di perdita di funzione su larga e media scala. Qui illustriamo i passaggi necessari per eseguire una schermata su larga scala dell'occhio mediata da RNA, a partire dall'allestimento della trasfezione ad alto rendimento fino allo sviluppo di un saggio appropriato. Ciò viene illustrato mediante l'allestimento di una schermata per identificare geni coinvolti nel progresso del ciclo cellulare nei mammiferi.Prima di tutto, mostriamo come avviene la trasfezione delle cellule ilar, ottimizzata, seguita dalla valutazione statistica della qualità del saggio. Infine, viene eseguita una schermata su scala genomica per misurare la distribuzione del ciclo cellulare dopo l'abbattimento del gene bersaglio. I risultati positivi vengono selezionati utilizzando la statistica zco e verificati mediante RNA interferenti indipendenti di facile realizzazione.Inoltre, illustriamo possibili procedure sperimentali che possono essere utilizzate per proseguire lo screening dell'occhio mediante RNA. Ciao, sono Ty presso l'Istituto Max Planck di Biologia Cellulare Molecolare e Genetica. E Tristan.Sono Frank Al, anch'io dell'Istituto Marx Plunk di Dresda. Oggi vi mostreremo un procedimento per impostare uno schermo di perdita di funzione in cellule di mammifero utilizzando gli RNA easy MISSION di Sigma Aldridge. Un saggio per misurare la distribuzione del ciclo cellulare in una popolazione di cellule in coltura tissutale sarà usato come esempio per dimostrare come i geni possano essere associati a un processo biologico mediante schermatura con RNAi.Iniziamo. Ogni progetto di screening a RNAi inizia con la scelta degli inneschi di silenziamento; gli siRNA, ovvero RNA a interferenza endogeni preparati, o brevemente easy RNA, vengono generati mediante digestione enzimatica limitata di RNA a doppio filamento utilizzando RNAsi tre. Ogni easy RNA viene verificato per identità mediante sequenziamento e per purezza mediante analisi con chip di laboratorio Caliper.L'unione di singoli siRNA che mirano tutti allo stesso trascritto aumenta la specificità, poiché ogni irna nel pool condivide lo stesso bersaglio primario, mentre gli effetti fuori bersaglio vengono diluiti. Pertanto, gli easy RNA presentano un'elevata efficacia di silenziamento e una specificità del bersaglio elevata, evitando effetti fuori bersaglio. Scala genomica easy.Le librerie di RNA sono fornite da Sigma Aldrich. In piastre da 384 pozzetti, con i pozzetti periferici vuoti. Inoltre, otto posizioni al centro della piastra vengono lasciate vuote per i controlli.Sono disponibili sottolibrerie di easy RNA in piastre a 96 pozzetti, con tutti i pozzetti occupati; in questo caso, i clienti possono decidere come gli easy RNA verranno disposti in tali piastre. Gli easy RNA individuali sono forniti in singole provette. La trasfezione di easy RNA richiede un'ottimizzazione in base ai diversi reagenti di trasfezione e alle linee cellulari utilizzate.Qui coltiviamo le nostre cellule seguendo procedure standard e utilizziamo l'oligonucleotide come reagente di trasfezione. Utilizziamo EEG five E-Z-R-N-A-A, una chinesina necessaria per l'assemblaggio del fuso bipolare, come controllo positivo e l'RNA facile di ran luciferasi come controllo negativo. In una piastra a 384 pozzetti, effettuiamo una titolazione con diverse quantità di RNA facile, ad esempio da un nanogrammo a 56 nanogrammi con incrementi di cinque nanogrammi, e quantità crescenti di reagente di trasfezione da 0,1 microlitri a 0,9 microlitri con incrementi di 0,05 microlitri.Dopo aver mescolato l'RNA e il reagente di trasfezione, aggiungere le cellule e incubare per 48 ore. Al termine del periodo di incubazione, esaminare le cellule al microscopio ottico. Contare le cellule trasfettate con eeg.Cinque RNA easy che mostrano una forma rotonda indicativa della mitosi. Contare inoltre il numero totale di cellule trasfettate con un controllo negativo. RNA easy di gran vanilla luciferasi.La condizione di trasfezione ottimale mostra la minima tossicità per la luciferasi vanilla e il fenotipo più pronunciato per EEG cinque. Ora che i parametri di trasfezione sono stati ottimizzati, procedere all'allestimento dello schermo primario. Le stazioni di pipettaggio automatizzate, come Matrix Wellm Mate o Tecan Aquarius, utilizzate per preparare gli schermi primari, devono essere posizionate sotto cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.Tutti i componenti utilizzati devono essere sanificati prima dell'uso, mediante autoclave se applicabile o spruzzando etanolo al 75% prima dello screening. Questi strumenti devono essere ottimizzati secondo i protocolli del produttore. Ottimizzare la precisione della pipettaggio per tutti i componenti utilizzati sulla stazione di pipettaggio automatizzata, poiché i parametri di pipettaggio variano a seconda del tipo di soluzione, del volume e del tipo di piastra.Questa ottimizzazione deve essere ripetuta separatamente per ogni passaggio. Inoltre, ottimizzare i protocolli di lavaggio in modo da escludere la cross-contaminazione da pozzetto a pozzetto quando le stazioni di pipettaggio automatizzate sono pronte. Trasfettare le cellule in formato a 384 pozzetti utilizzando le condizioni ottimizzate precedentemente determinate per assicurarsi che non vengano osservati effetti di posizione.Utilizzare RNA facilmente amplificabili per EEG cinque e luciferasi vanillina con un modello alternato che copre l'intera piastra. Lasciare vuote tutte le pozzette periferiche poiché un problema comune nell'uso delle piastre a pozzette multiple è l'evaporazione accentuata nelle pozzette esterne durante il periodo di incubazione. Ciò determina condizioni sperimentali diverse in pozzette diverse, il che spesso si traduce in effetti legati alla posizione sulla piastra; per ridurre ulteriormente l'evaporazione, utilizzare barriere anti-evaporazione come il nastro traspirante Corning.Assicurarsi inoltre che gli incubatori siano mantenuti a elevata umidità. Tuttavia, ricordare che esistono possibili fonti di effetti di posizione, come variazioni nel trattamento dei liquidi o nel sistema di lettura, ad esempio un lettore di piastre. Dopo un'incubazione di 48 ore, fissare le cellule con etanolo al 100% freddo di ghiaccio per due ore, quindi reidratarle in PBS per 15 minuti.Colorare le cellule fissate per 25 minuti in PBS contenente un microgrammo per millilitro di DPI e 100 microgrammi per millilitro di RNA. Lavare quindi tre volte con PBS e conservare a quattro gradi Celsius. Successivamente, misurare l'intensità della fluorescenza di DPI mediante microscopia.Viene utilizzato qui un sistema scanner Olympus per ciascuno. Esamineremo le cellule e determineremo l'intensità relativa di DPI. Generare un istogramma riportando l'intensità di DPI in funzione del numero di cellule sulla base dell'istogramma.Valutare la distribuzione del ciclo cellulare calcolando la percentuale di cellule con un contenuto di DNA di 2N per la fase G1/G0, compreso tra 2N e 4N per la fase S, 4N per la fase G2/M e superiore a 4N per aneuploidia o poliploidia. Per valutare l'omogeneità dei risultati sulla piastra, confrontare la distribuzione del ciclo cellulare tra le diverse pozzette confrontando la percentuale di cellule in fase G2/M per EEG5 e luciferasi trasfettate; se i risultati differiscono significativamente sulla piastra, è necessaria un'ulteriore ottimizzazione per eliminare gli effetti di posizione. Una volta soddisfatti della coerenza dei risultati, calcolare le differenze statistiche tra i controlli positivi e negativi.Utilizzare l'equazione del fattore Z mostrata qui per determinare la significatività statistica dei risultati. SD indica la deviazione standard e AV indica la media. Un fattore Z compreso tra uno e 0,5 indica una separazione statisticamente significativa tra i controlli negativi e il rumore rispetto ai controlli positivi.Se tale differenza statistica è stata stabilita, si può procedere alla schermata primaria. Preparare piastre per coltura cellulare a 384 pozzetti per la trasfezione di RNA facilmente trasfettivabili utilizzando le condizioni ottimizzate predeterminate qui.15 nanogrammi di RNA facile per pozzetto vengono disciolti in cinque microlitri di tampone TE. Almeno otto posizioni di controllo per piastra vengono caricate con controlli positivi e negativi adeguati per il processo biologico. Studiati qui, EEG cinque e ranil luciferasi.Gli RNA facili vengono utilizzati per evitare effetti di posizione. I pozzetti periferici vengono caricati con cinque microlitri di tampone TE soltanto. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di opti MEM contenenti 0,2 microlitri di oligo per pozzetto di mix e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver mescolato l'RNA con il reagente di trasfezione, aggiungere qui la sospensione cellulare. Si aggiungono 40 microlitri di una sospensione di cellule he R a una concentrazione di 25 cellule per microlitro, pari a 1000 cellule per pozzetto, e si incuba per 72 ore. Dopo l'incubazione di 72 ore.Misurare il contenuto di DNA mediante un microscopio automatizzato, come l'Olympus scan R, come mostrato in precedenza. Ripetere questa procedura per tutte le piastre della libreria per la selezione dei risultati positivi. Valutare i valori del contenuto di DNA utilizzando la statistica del punteggio Z.Si noti che lo Z-score non è la stessa cosa del fattore Z Z-score. Fornisce una misura statistica della significatività del valore del campione rispetto a un controllo negativo o fittizio. Viene calcolato secondo l'equazione mostrata qui.Calcolare lo zco per tutti i campioni di RNA semplici utilizzando il segnale del controllo negativo di luciferasi vanilla come riferimento per la selezione dei risultati positivi. È necessario applicare una soglia. Generalmente, si utilizza un criterio di significatività per Z maggiore di due o minore di meno due. Tuttavia, a seconda del processo biologico studiato o dell'obiettivo della schermata, possono essere applicate soglie diverse.Metodi di valutazione matematica più complessi, come il Q, possono essere utilizzati anche per la selezione dei risultati positivi. Successivamente, i risultati positivi selezionati vengono sottoposti a un test secondario e a una validazione HIIT. Un test secondario dei geni HIIT selezionati segue il test primario al fine di eliminare i falsi positivi dovuti alla variabilità sperimentale.Prima di tutto, verificare i risultati selezionati utilizzando lo stesso procedimento dello schermo primario, ma impostando i risultati con un numero maggiore di repliche, compreso tra tre e cinque, per consentire una migliore valutazione statistica. Per i risultati confermati, utilizzare lo stesso saggio e lettura dello schermo primario, ma con un RNA interferente secondario non sovrapposto o un altro innesco di silenziamento non sovrapposto, come un siRNA sintetizzato chimicamente. Convalidare infine i geni selezionati mediante analisi interspecie.Il rescue dell'RNAi costituisce lo standard aureo per la verifica dei fenotipi dell'RNAi disponibile allo stato attuale. In breve, un cromosoma artificiale batterico, abbreviato in back, che codifica un ortologo di una specie diversa rispetto al gene selezionato, viene trasfettato stabilmente nelle cellule. I costrutti back preservano il gene nel suo contesto genomico e consentono un'espressione quasi fisiologica.l'RNAi contro il gene endogeno lascerà inalterata l'espressione del transgene ortologo, il che determina il recupero del fenotipo dell'RNAi. Infine, i candidati validati vengono studiati in modo più approfondito per ottenere alla fine una comprensione meccanicistica. In molti casi, l'RNAi può essere utilizzato anche in questi saggi secondari più complessi.Ad esempio, microscopia a intervalli di fenotipi da RNAi. Di seguito è riportato un esempio di schermata del ciclo cellulare in cui il contenuto di DNA di cellule R heal è stato misurato dopo l'abbassamento di oltre 16.000 geni del genoma umano. Sono stati identificati 1.351 risultati primari necessari per la divisione cellulare.Nella schermata secondaria, i 743 risultati positivi sono stati verificati mediante un secondo trigger di RNA interferente indipendente, utilizzando un saggio secondario. Gli abbattimenti genici che hanno determinato un arresto in fase G2 sono stati separati da quelli che hanno causato un arresto mitotico. Infine, è stato eseguito un esperimento di recupero dell'occhio mediato da RNA in diverse specie per il gene Lin 54, al fine di confermarne il ruolo nella divisione cellulare corretta.Esperimenti successivi hanno mostrato che l'esaurimento di Lin 54 alterava l'espressione di molti geni del ciclo cellulare. Vi abbiamo appena mostrato come impostare la trasfezione ad alto rendimento di RNA Mission Easy e l'analisi della distribuzione del ciclo cellulare nella linea cellulare di coltura tessutale umana. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le condizioni di trasfezione e i saggi devono essere ottimizzati separatamente per ogni sistema cellulare e ogni processo biologico.L'uso di sistemi automatizzati per la manipolazione dei liquidi è raccomandato ma non indispensabile, specialmente per schermate su piccola scala. Anche la manipolazione manuale è fattibile. È tutto qui. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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