drosofila Dissezione della ghiandola accessoria maschile: un metodo per isolare le cellule secondarie

0 visualizzazioni2:59 min • April 30th, 2023

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- Sotto un microscopio da dissezione e in terreni integrati con siero, rimuovere il tratto riproduttivo da ciascun moscerino con una pinza. Innanzitutto, rimuovi le parti del tratto digestivo che potrebbero aver accompagnato il tratto riproduttivo. Per isolare le ghiandole accessorie e il dotto eiaculario, rimuovere i testicoli, il bulbo eiaculatorio e i terminali. Lavare il fazzoletto per uno o due minuti in PBS per rimuovere il siero. Quindi, trasferiscilo nella soluzione di dissociazione.

Per esporre le cellule all'interno delle ghiandole alla soluzione di dissociazione, tenere il centro di ciascuna ghiandola con una pinza e tagliare la ghiandola con un paio di pinze affilate. Rimuovere la porzione prossimale della ghiandola e il dotto eiaculatorio per lasciare dietro di sé l'estremità distale delle ghiandole contenente la rara popolazione di cellule secondarie responsabile della secrezione di proteine coinvolte nell'accoppiamento. Infine, trasferire le punte dei pressacavi accessori in una provetta da microcentrifuga in preparazione per la digestione. Nel seguente protocollo, sezioniremo le ghiandole accessorie per isolare le cellule secondarie per l'analisi del trascrittoma.

- Prima di iniziare la procedura, tagliare e fiammare le punte da 200 microlitri per la manipolazione delle ghiandole e passare l'apertura della punta di più punte da 1000 microlitri vicino a una fiamma per meno di un secondo per restringere le aperture. Quindi, ordina le punte modificate da più strette a più larghe in base alla loro velocità di aspirazione. Per la dissezione della ghiandola accessoria, posizionare da 20 a 25 drosofila maschio in un piatto di vetro sul ghiaccio e utilizzare una pinza e un microscopio da dissezione per rimuovere il tratto riproduttivo di una mosca maschio.

Eliminare la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti, compresi i testicoli e il bulbo eiaculatorio, e trasferire le ghiandole accessorie in una lastra di vetro contenente terreno integrato con siero a temperatura ambiente. Quando sono state raccolte 20 paia di ghiandole accessorie, lavare le ghiandole in un piatto di PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Alla fine del lavaggio, trasferire le ghiandole in una soluzione di dissociazione appena preparata e utilizzare una pinza affilata al microscopio da dissezione per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare.

Usando un secondo paio di pinze, tagliare il tessuto con la punta affilata per separare la regione prossimale della ghiandola accessoria e del dotto eiaculatorio dalla porzione della ghiandola contenente le cellule secondarie. Quindi, utilizzare un puntale per pipetta largo 200 microlitri arrotondato a fiamma pre-bagnata per trasferire i premistoppa in una provetta da 1,5 millilitri.

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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026