JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 4:49 min • April 30th, 2023
- Inizia montando una larva pulita e anestetizzata sotto un vetrino di vetro con la testa rivolta verso l'alto. Quindi, esponi l'area di interesse spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti per arrotolare la larva e regolarne la posizione. Usa l'imaging confocale per localizzare le cellule neurali della larva. Identificare un assone specifico su una delle cellule neurali bersaglio come sito per la lesione.
Quindi esporre l'assone bersaglio a un laser a due fotoni a una potenza superiore a quella utilizzata per l'imaging per indurre danni. Un laser a due fotoni viene utilizzato grazie alla sua capacità di penetrare e localizzare con precisione il danno all'interno del tessuto vivo con un danno minimo al tessuto circostante.
Interrompere immediatamente l'esposizione al laser quando si verifica un danno al neurone bersaglio, con conseguente assotomia o recisione dell'assone. Infine, immagina il neurone danneggiato per visualizzare la sua degenerazione e la successiva rigenerazione nei punti temporali desiderati.
Nel protocollo di esempio, monteremo una larva per la microscopia, indurremo danni ai neuroni sensoriali larvali e monitoreremo la rigenerazione neurale.
- Inizia con un'anestetizzazione delle larve. In una cappa aspirante, posizionare una capsula di vetro da 60 millimetri in una capsula di Petri di plastica da 15 centimetri. Quindi piega un pezzo di carta velina e mettilo nella pirofila di vetro. Posizionare la piastra di agar d'uva sul tessuto dopo aver aggiunto l'etere dietilico.
Quindi, su un vetrino, posizionare una goccia di olio alocarbonico 27 al centro e posizionare una macchia di grasso sottovuoto su ciascuno dei quattro angoli. Quindi usa una pinza per trasferire una larva sulla piastra di agar e copri il piatto di vetro per anestetizzare la larva. Non appena la lava smette di muoversi, trasferirla con cura nell'olio alocarbonico con la testa in posizione verticale. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino e premerlo delicatamente fino a toccare la larva.
Quindi, usa una forza delicata per far scorrere il vetrino coprioggetto per far rotolare le celle da ablare nel punto in cui il laser a due fotoni le colpirà più facilmente. La posizione varierà a seconda dei neuroni presi di mira. Ora fissa il gruppo sul tavolino del microscopio a due fotoni e metti a fuoco le celle di interesse utilizzando un obiettivo a immersione in olio 40x.
Nel software, passare alla modalità di scansione e caricare il protocollo salvato. Assicurati che il foro stenopeico sia completamente aperto. Quindi, in modalità live, ottieni una buona immagine della regione di interesse.
Quindi, interrompi la scansione in tempo reale in modo che il pulsante di ritaglio diventi disponibile. Utilizzando la funzione di ritaglio, regolare la finestra di scansione per focalizzare l'area target solo sul potenziale sito della lesione. Quindi apri una nuova finestra di imaging. Ora riduci la velocità di scansione e aumenta l'intensità del laser. Quindi attiva o disattiva il pulsante continuo per avviare e interrompere la scansione. Guarda attentamente. Non appena si verifica un drastico aumento della fluorescenza, terminare la scansione.
Quindi, torna alla finestra di imaging originale e seleziona la modalità live e trova la regione che è stata appena presa di mira regolando la messa a fuoco.
- Una buona indicazione di una lesione riuscita è la comparsa di un piccolo cratere, di una struttura ad anello o di detriti localizzati proprio sul sito della lesione. Se la potenza del laser fosse troppo alta, sarebbe visibile una grande area danneggiata, che può essere letale.
- Ora rimuovi con cura il vetrino coprioggetto e trasferisci la larva ferita su un nuovo piatto con pasta di lievito. Metti il piatto in un piatto da 60 millimetri insieme a un fazzoletto imbevuto di acido propionico. Quindi riportare la piastra alla temperatura di coltura.
Per l'imaging successivo della larva, utilizzare la configurazione confocale salvata e raccogliere immagini della pila z con un obiettivo 25x. Assicurarsi di includere il punto di normalizzazione in modo che la rigenerazione possa essere quantificata.