Screening per le modifiche genomiche: un metodo per identificare i mutanti generati da CRISPR in Drosophila

- Quando gli embrioni iniettati si sviluppano in adulti G0, incrociare tutti i singoli moscerini con ceppi bilanciatori adatti per espandere le potenziali linee modificate F1 CRISPR ed essere in grado di tracciare l'ereditarietà della modifica genomica. Quindi, incrocia maschi singoli F1 scelti casualmente con femmine bilanciatrici adatte per essere in grado di recuperare la prole se un maschio F1 è positivo per la mutazione. Una volta che la croce è stata effettuata, trasferire il maschio F1 in una provetta per lo screening.

Per estrarre il DNA genomico, schiacciare la mosca con una punta per pipetta contenente un tampone di estrazione. Una volta che il tessuto è stato scomposto, espellere il liquido. Il tampone di estrazione contiene proteinasi K, un enzima che digerisce le proteine nel campione e viene inattivato dal calore elevato.

Ora che il DNA è accessibile, procedere allo screening PCR. Ad esempio, utilizzare primer progettati per amplificare una regione che include la nuova sequenza. Solo in presenza della modifica si legherà il secondo primer e verrà amplificato un prodotto per PCR. Nell'esempio, vedremo i moscerini allevati e sottoposti a screening mediante PCR per l'ins