0 visualizzazioni • 3:08 min. • April 30th, 2023
- Per immobilizzare le mosche per l'inclusione della paraffina, spingere con cautela la Drosophila anestetizzata attraverso la fessura di un collare antimosche in modo che le loro teste siano posizionate uniformemente sulla parte superiore del dispositivo mentre sono ancora attaccate al resto del corpo. Per il fissaggio dei tessuti, posizionare i collari nella soluzione di Carnoy. Quello di Carnoy è un agente di fissazione denaturante costituito da etanolo, cloroformio e acido acetico.
Per preparare il campione per l'infiltrazione di paraffina, disidratare il tessuto trasferendo il colletto attraverso concentrazioni graduate di etanolo. Quindi, trasferire il collare nel metilbenzoato, un solvente organico. Quindi, mettilo in una soluzione di metil benozoato e paraffina fusa mentre viene riscaldato per assicurarti che la paraffina rimanga sciolta. Procedere a un'elaborata serie di fasi di lavaggio con la sola paraffina preriscaldata per rimuovere il metilbenzoato.
Successivamente, posizionare rapidamente il collare in uno stampo e versare la paraffina fusa fino a coprirlo completamente. Una volta che la paraffina si è indurita, rimuovere il blocco dallo stampo e utilizzare una lama di rasoio per tagliare la paraffina in eccesso. Rompere il colletto lasciando la fila di teste incorporate nel blocco di paraffina. Nel protocollo di esempio, vedremo la procedura dimostrata per l'analisi dei fenotipi neurodegenerativi.
- Per iniziare, per prima cosa, usa una pinza per infilare le mosche del soggetto per il collo nei collari. Allineare tutte le testine con lo stesso orientamento e assicurarsi che non si verifichino danni alla testa o agli occhi. Includi mosche sine oculis senza occhi in posizioni note casuali in modo che l'ordine delle mosche possa essere facilmente identificato nelle sezioni. Inoltre, se il ceppo di mosca di interesse ha gli occhi chiari o bianchi, infilare le mosche dagli occhi rossi a intervalli lungo la striscia per assicurarsi che sia presente una quantità sufficiente di pigmento per macchiare il vetrino.
Registrare l'ordine delle mosche insieme al numero del collare se ne viene utilizzata più di una. Una volta terminato il collare, immergilo nella soluzione di Carnoy per 3,5-4 ore. Eseguire una serie di lavaggi con etanolo, metilbenzoato e paraffina per preparare il tessuto del moscerino per l'inclusione. Quindi, posiziona i collari in una vaschetta per cubetti di ghiaccio in gomma, uno per sezione.
Versare delicatamente la paraffina fusa sui colletti evitando bolle d'aria e lasciarla indurire durante la notte. Rimuovere i blocchi di paraffina contenenti i collari dal vassoio. Separare il blocco di paraffina dal collare usando una lama di rasoio, rompendo delicatamente il collare. I corpi rimarranno nel colletto mentre le teste rimarranno nel blocco di paraffina.