Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti della Drosophila

- La ghiandola linfatica larvale di Drosophila melanogaster è responsabile della produzione di emociti, o cellule del sangue, che circolano nell'emolinfa larvale. Per identificare la ghiandola linfatica, prima trova il vaso dorsale, o cuore, che pompa l'emolinfa in tutto il corpo. Segui il vaso dorsale verso la testa fino a trovare il cervello. La ghiandola linfatica è una piccola struttura multilobata accanto al cervello, che fiancheggia il vaso dorsale.

Per trovare il lobo primario, identificare il lobo più grande della ghiandola. Questo lobo contiene tre zone, definite da diversi stadi di sviluppo degli emociti. La zona midollare più vicina al vaso dorsale contiene emocita immaturo, mentre la zona corticale contiene emociti maturi. All'estremità posteriore del lobo primario, si trova il centro di segnalazione posteriore, composto da emociti specializzati. I lobi secondario e terziario sono più piccoli e non hanno zone definite.

Per sezionare la ghiandola linfatica, avrai bisogno di un microscopio da dissezione, due pinze per manipolare le larve e una soluzione salina tamponata.

In questo esempio, sezioniremo le ghiandole linfatiche per l'uso in immunoistochimica.

- Per iniziare la dissezione delle ghiandole linfatiche, aggiungere 1 millilitro di 1x PBS a 1 pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per ogni impostazione sperimentale da sezionare. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento monouso, aggiungere 1 goccia di PBST allo 0,1% in ciascun pozzetto. Posizionare il piatto sul ghiaccio. Posizionare un tampone di dissezione pulito su una base illuminata per stereomicroscopio. Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso per posizionare una goccia di PBST allo 0,01% sul tampone.

Trasferire una larva nella goccia PBST per la dissezione. Tenere la lava con un paio di pinze, con la parte dorsale rivolta verso l'alto, a circa 1/4 di lunghezza dall'estremità posteriore. Con il secondo paio di pinze, afferra la cuticola immediatamente anteriormente al primo paio e tira delicatamente la cuticola larvale verso la parte anteriore, fino a quando i ganci della bocca non sono esposti.

Rilascia la cuticola e usa entrambe le pinze per dividere in due la larva. Rimuovere l'estremità posteriore dalla goccia PBST e gettarla. Fissa la cuticola per stabilità, quindi usa il secondo paio di pinze per afferrare i ganci della bocca esposti ed estrarli delicatamente. Questo separerà la cuticola dalle strutture interne.

Tenendo i ganci della bocca, rimuovere con cura le strutture indesiderate, come le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino. Raccogliere delicatamente il complesso di tessuto sezionato dai ganci per la bocca e trasferirlo in un pozzetto della piastra su ghiaccio. Ripetere la dissezione con tutte le larve desiderate, ma non superare un tempo di dissezione di 30 minuti prima di procedere alla fase di fissazione.

Per iniziare il montaggio dei tessuti, posizionare una goccia di tampone di montaggio su un vetrino. Usando i ganci per la bocca come maniglia, trasferire la ghiandola linfatica nella gocciolina tampone. Distanziare i tessuti in modo uniforme, distribuendo il tampone di montaggio nel processo.

Far scorrere con cautela una pinza sotto il vaso dorsale, tirando delicatamente verso la periferia del tampone di montaggio per estrarre e appiattire la ghiandola linfatica. Con un movimento di segatura, tagliare il vaso dorsale tra la ghiandola linfatica e il cervello. Spostare il resto dei tessuti lontano dalla ghiandola linfatica verso il bordo più esterno del tampone.

Prelevare un vetrino coprioggetti pulito e abbassarlo con cautela sul tampone di montaggio. I vetrini sono ora pronti per l'imaging o possono essere conservati a 4 gradi Celsius fino al momento del bisogno.