0 visualizzazioni • 3:55 min. • April 30th, 2023
- Per prima cosa, raccogli le mosche allo stadio di sviluppo desiderato e mettile in una provetta sterile. Per contare solo il microbiota interno, sterilizzare l'esterno delle mosche immergendole in etanolo al 70%. Per misurare sia il microbiota interno che quello esterno, saltare questa fase di sterilizzazione. Quindi, macinare le mosche in un piccolo volume di terreno di coltura batterica utilizzando perle di ceramica e un omogeneizzatore di tessuti, o manualmente con un pestello. Prestare attenzione a non introdurre batteri da fonti esterne, per evitare di contaminare i campioni.
Ora dovresti avere una miscela omogenea contenente batteri che puoi coltivare. Aumentare il volume dell'omogeneizzato utilizzando un mezzo batterico liquido. Eseguire diluizioni seriali dell'omogeneizzato e piastrare, un volume costante di queste diluizioni sul terreno di crescita solido appropriato per i batteri. Man mano che i batteri crescono, si formeranno colonie sul piatto. Trova la diluizione che ha un intervallo da 10 a 100 colonie per determinare le unità formanti colonie, o CFU, del campione.
Nel protocollo di esempio, inoculeremo mosche sterili con una coltura gnotobiotica o batterica definita e raccoglieremo e misureremo le CFU.
- Utilizzare i puntali del filtro per trasferire 100 microlitri di crescita notturna in un tubo sterile per microfuge. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascuna coltura in una piastra a 96 pozzetti. Rimuovere i campioni dalla cabina di biosicurezza e centrifugarli per pellettare i batteri. Dopo aver effettuato diluizioni di una, due e quattro volte, misurare la densità ottica o OD600 su uno spettrofotometro a lettura di piastre a più pozzetti.
Dopo aver ottenuto l'OD600, rimuovere il surnatante con un puntale per pipetta e utilizzare mMRS fresco per risospendere il pellet. Mescola i ceppi batterici diluiti in rapporti uguali per creare un cocktail multispecie. Trasferire 50 microlitri di cocktail nei tubi conici contenenti la dieta sterile e le uova decorionate. Assicurati di aggiungere i batteri dopo il trasferimento dell'uovo per evitare la contaminazione tra le fiale. Quindi posizionare le provette inoculate in un'incubatrice.
Per misurare le unità formanti colonie o CFU, trasferire cinque mosche in una provetta per microfuge da 1,7 millilitri contenente 125 microlitri di perle di ceramica e 125 microlitri di brodo mMRS. Omogeneizzare le mosche utilizzando un omogeneizzatore di tessuti. Non dovrebbero esserci pezzi interi che rimangono alla mosca. Quindi, diluire l'omogenato con 875 microlitri di mMRS, agitare l'omogenato per cinque secondi e pipettare 120 microlitri nel primo pozzetto di una piastra per microtitolazione.
Togliere 10 microlitri dal primo pozzetto e aggiungerlo al secondo pozzetto contenente 70 microlitri di MRS. Mescolare accuratamente il contenuto del secondo pozzetto. Quindi trasferire 10 microlitri dal secondo pozzetto al terzo pozzetto contenente 70 microlitri di MRS e mescolare accuratamente. Trasferire 10 microlitri di ciascuna diluizione in una piastra mMRS. Inclinare leggermente il piatto per distribuire la diluizione di diversi millimetri lungo la superficie dell'agar e lasciare asciugare il liquido prima di spostare il piatto. Rimuovere le piastre dall'incubatrice una volta che sono visibili le singole colonie distinte e contarle da una diluizione con 10-100 colonie isolate. Infine, calcola i CFU per mosca.