Elaborazione delle zampe degli insetti per la microscopia a fluorescenza: un metodo per preservare le strutture neuromuscolari per l'imaging

- Per iniziare, immergere gli insetti anestetizzati in una soluzione di etanolo al 70% per ridurre l'idrofobicità della cuticola. Quindi, lavare e permeabilizzare il tessuto con soluzione fisiologica tamponata con fosfato contenente un detergente per almeno 30 minuti per consentire la penetrazione del tessuto durante la fissazione.

Quindi, rimuovi la testa e l'addome dal torace. Usa il forcipe per applicare una leggera pressione alla giunzione coxa-torace e staccare la gamba. Posizionare con cura le gambe in una soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% durante la notte per consentirne la penetrazione nel tessuto. La paraformaldeide fissa i tessuti attraverso la reticolazione delle proteine.

Quindi, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare più volte il fazzoletto con un detergente contenente soluzione salina tamponata con fosfato. Prima del montaggio, posizionare le gambe in un tampone di montaggio puro o leggermente diluito per almeno un giorno in modo da fornire il tempo sufficiente affinché il tampone entri nel tessuto.

Infine, montare le gambe in una goccia di mezzo di montaggio. Utilizzare un distanziatore tra il vetrino del microscopio e il vetrino coprioggetti per e