Elaborazione delle zampe degli insetti per la microscopia a fluorescenza: un metodo per preservare le strutture neuromuscolari per l'imaging

- Per iniziare, immergere gli insetti anestetizzati in una soluzione di etanolo al 70% per ridurre l'idrofobicità della cuticola. Quindi, lavare e permeabilizzare il tessuto con soluzione fisiologica tamponata con fosfato contenente un detergente per almeno 30 minuti per consentire la penetrazione del tessuto durante la fissazione.

Quindi, rimuovi la testa e l'addome dal torace. Usa il forcipe per applicare una leggera pressione alla giunzione coxa-torace e staccare la gamba. Posizionare con cura le gambe in una soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% durante la notte per consentirne la penetrazione nel tessuto. La paraformaldeide fissa i tessuti attraverso la reticolazione delle proteine.

Quindi, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare più volte il fazzoletto con un detergente contenente soluzione salina tamponata con fosfato. Prima del montaggio, posizionare le gambe in un tampone di montaggio puro o leggermente diluito per almeno un giorno in modo da fornire il tempo sufficiente affinché il tampone entri nel tessuto.

Infine, montare le gambe in una goccia di mezzo di montaggio. Utilizzare un distanziatore tra il vetrino del microscopio e il vetrino coprioggetti per evitare danni al campione e fissare la montatura con lo smalto per unghie.

Nell'esempio seguente, vedremo la dissezione, la fissazione e il montaggio delle zampe di Drosophila melanogaster.

- Iniziare riempiendo il numero appropriato di pozzetti in una piastra multipozzetto di vetro con etanolo al 70%. Usa un pennello per aggiungere da 15 a 20 mosche anestetizzate con anidride carbonica di qualsiasi età o sesso in ogni pozzetto e tampona delicatamente le mosche nell'etanolo fino a quando non sono completamente sommerse.

Dopo non più di un minuto, sciacquare le mosche tre volte con una soluzione detergente di tensioattivo non ionico allo 0,3% in soluzione salina tamponata con fosfato per almeno 10 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, usa una pinza per rimuovere la testa e l'addome di ogni mosca senza danneggiare il segmento toracico o le gambe, e usa la punta di un paio di pinze sottili per applicare delicatamente ma con fermezza pressione alla giunzione coxa-torace per staccare una gamba dal segmento toracico.

Mettere le gambe in un pozzetto di una nuova piastra multipozzetto, contenente il 4% di paraformaldeide appena preparata su ghiaccio, per un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius.

- È importante spingere delicatamente le gambe nel tampone di fissazione senza lasciarle fluttuare per ottenere gambe ben fissate.

- Il giorno successivo, lavare le gambe cinque volte in una soluzione detergente fresca di tensioattivo non ionico allo 0,3% per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il detersivo con il mezzo di montaggio e mantenere le gambe nel supporto di montaggio per almeno 24 ore.

Il giorno successivo, aggiungere circa 20 microlitri di glicerolo al 70% accanto all'estremità rivestita del vetrino da microscopio e coprire il glicerolo con un vetrino coprioggetti da 22 x 22 millimetri. Quindi, aggiungere circa 10 microlitri di terreno di montaggio a destra del vetrino coprioggetti e applicare un secondo filo da 30 microlitri di mezzo di montaggio a destra del tubo da 10 microlitri.

Utilizzando una pinza fine, trasferire una gamba dalla piastra multipozzetto in una goccia di terreno alla striscia da 10 microlitri di terreno di montaggio con un orientamento esterno verso l'alto o verso il basso. Ripetere fino a quando non sono state montate e allineate da sei a otto zampe e posizionare un secondo vetrino coprioggetti sulle gambe in modo che il secondo vetrino coprioggetti poggi leggermente sul primo vetrino coprioggetti. Quindi, usa lo smalto per unghie su ogni angolo dei vetrini coprioggetti per fissarli in posizione.