JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 3:56 min • April 30th, 2023
- Nella mosca adulta, i muscoli del volo indiretto, o IFM, sono i muscoli più grandi della mosca che si estendono su tutto il torace. Gli IFM orchestrano i caratteristici movimenti delle ali ad alta frequenza nelle mosche a due ali, inclusa la Drosophila. Due gruppi opposti di fibre muscolari comprendono gli IFM.
In primo luogo, i muscoli longitudinali dorsali, o DLM, si trovano lungo il piano mediano del torace sopra l'intestino e si estendono da anteriore a posteriore. In secondo luogo, i muscoli ventrali dorsali, o DVM, si estendono dall'alto verso il basso del torace e sono fiancheggiati dal TDT, o muscolo del salto. Entrambi i gruppi muscolari sono attaccati alla cuticola.
Entro circa 48 ore dalla formazione del pupario, o APF, gli IFM in maturazione possono essere identificati visivamente con un semplice microscopio da dissezione. Nel protocollo di esempio, raccoglieremo IFM da pupe con APF superiore a 48 ore per l'analisi ad alto rendimento.
- Per la dissezione IFM dopo 48 ore di APF, utilizzare un pennello leggermente bagnato per trasferire le pupe stadiate su una striscia di nastro biadesivo montata su un vetrino da microscopio. Orientare le pupe in linea, con il lato ventrale rivolto verso il basso e anteriormente verso la parte inferiore del vetrino. Quando tutte le pupe sono state posizionate, usa una pinza per separare e aprire la prima custodia pupale sopra gli spiracoli anteriori e fai scorrere delicatamente un paio di pinze dorsalmente verso la parte posteriore, tagliando la custodia pupale mentre le pinze si muovono.
Liberare la pupa dalla custodia aperta e trasferire immediatamente la pupa in una goccia di PBS su un secondo vetrino da microscopio. Quando tutte le pupe sono state liberate, usa le forbici sottili per tagliare l'addome delle pupe lontano dal torace e spingere gli addomi in un mucchio separato. Quando tutti i torace sono stati rimossi, utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere la maggior parte del PBS e la pila di addomi.
Aggiungere una goccia di PBS fresco raffreddato al torace rimanente prima di usare le forbici per tagliare dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo in un unico movimento per dividere il torace a metà. Quando tutte le pupe sono state sezionate, utilizzare la pinza numero cinque per selezionare una delle emisezioni e inserire delicatamente le punte di una pinza sopra e sotto il centro delle IFM.
Tenendo fermo il primo paio di pinze, usa le forbici sottili per tagliare un'estremità dell'IFM lontano dalla cuticola e dai tendini prima di ruotare la pupa di 180 gradi per consentire all'altra estremità dell'IFM di essere tagliata dalla cuticola e dai tendini. Usa una pinza per trasferire il fascio IFM dal torace al bordo della bolla PBS usando la tensione dell'acqua per tenere il fascio in posizione.
Quindi, spingere la carcassa sul lato opposto del vetrino e sezionare il resto degli IFM allo stesso modo. Quando tutti gli IFM sono stati raccolti, utilizzare la pinza numero cinque per rimuovere eventuali frammenti di muscolo saltatore o cuticola che potrebbero aver trovato la loro strada nei campioni. Quindi, utilizzare la tensione dell'acqua per catturare delicatamente gli IFM sezionati tra un paio di pinze e posizionare gli IFM in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS refrigerato.