C. elegans Estrusione delle gonadi: una tecnica di dissezione rapida

- In una provetta contenente tampone M9, raccogliere fino a 150 vermi ermafroditi allo stadio di sviluppo desiderato. Rimuovere i batteri dai vermi lavandoli con un tampone M9 e centrifugando il campione.

Osservare la provetta al microscopio da dissezione quando si rimuove il surnatante per evitare la perdita del campione. Trasferire i vermi in un piatto di vetro con un volume minimo di tampone M9. Aggiungere levamisolo per anestetizzare i vermi.

Individua la testa del verme e la faringe, o intestino anteriore, che contiene due strutture a forma di bulbo. Ho usato due aghi per tagliare il verme dietro la faringe. Assicurarsi di completare rapidamente la dissezione per evitare di intaccare il tessuto.

Una volta che la cuticola è distrutta, i due bracci delle gonadi vengono estrusi o spinti fuori dal corpo a causa della pressione interna del verme.

In questo esempio, sezioniremo le gonadi di vermi adulti per l'analisi in immunofluorescenza.

- Raccogli da 100 a 150 vermi allo stadio di sviluppo desiderato e raccoglili in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di tampone M9. Quindi, riempire la provetta della microcentrifuga con altri 900 microlitri di tampone M9 e centrifugarla a 1.000 volte g per 1 minuto a temperatura ambiente.

Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere delicatamente 900 microlitri del tampone M9. Quindi, ripeti il lavaggio altre due volte per rimuovere la maggior parte dei batteri attaccati.

Successivamente, utilizzando un puntale per micropipetta da 200 microlitri con un foro allargato, trasferire i vermi in 100 microlitri di tampone M9 su un piatto di vetro a fondo piatto. Quindi, aggiungere da 1 a 3 microlitri di levamisolo molare 0,1 al piatto e agitarlo delicatamente. Ora, collega due aghi calibro 25 a due siringhe per creare uno strumento di dissezione per ogni mano.

Sotto un microscopio da dissezione, posiziona ogni ago sotto e sopra ogni verme e fai un taglio sottile su ogni verme vicino al secondo bulbo faringeo usando un movimento simile a una forbice. Taglia tutti gli animali almeno una volta entro cinque minuti affinché il levamisolo rimanga efficace.

- È molto importante che la dissezione degli animali nella capsula sia completata in meno di cinque minuti.

- Nel caso in cui una gonade estrusa non sia visibile, basta saltare quell'animale. Qui sono visibili le gonadi estruse corrette.