PCR a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il DNA genomico

- Per l'analisi PCR di un singolo verme, consentire a un verme ermafrodita di autofecondarsi e deporre uova che produrranno una prole geneticamente identica e quindi preservare una copia del ceppo modificato. Quindi, trasferire il genitore in una provetta contenente tampone di lisi dei vermi.

Congelare il tubo a meno 80 gradi Celsius per aprire la cuticola o lo strato esterno. Riscaldare il campione a più di 60 gradi Celsius per lisare le cellule del verme che rilasciano le proteine intracellulari insieme al DNA genomico della cellula. A questa temperatura, la proteinasi K all'interno del tampone degrada le proteine, in particolare le nucleasi che altrimenti distruggerebbero il DNA genomico.

Quindi, aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius per inattivare l'enzima. Infine, aggiungere il lisato cellulare a una provetta con una miscela master PCR composta da tampone di reazione, dNTP, primer diretti e inversi per la regione di interesse, taq polimerasi e acqua portando la reazione al volume finale desiderato. Per eseguire la PCR, eseguire il programma di termociclatore appropriato che amplifica la regione del DNA di interesse.

Nell'esempio seguente, vedremo una procedura PCR per lo