Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: un metodo per isolare le cellule vive

- Iniziare con vermi pellettati lavati e aggiungere un tampone di lisi contenente SDS, un detergente, e DTT, un agente riducente. Questo rompe la cuticola protettiva del verme, esponendo il corpo alla dissociazione cellulare. Evitare l'esposizione prolungata al tampone di lisi per ridurre al minimo la lisi cellulare e la morte.

Quindi, rimuovere i reagenti di lisi con diversi lavaggi di tampone di isolamento freddo. È importante che questo tampone abbia la corretta osmolarità per prevenire la morte cellulare. Utilizzare un enzima proteasi per rompere le connessioni cellula-cellula. Aiuta il processo di omogeneizzazione insieme all'energia meccanica pipettando la miscela contro la parete del tubo.

Aggiungere terreni contenenti siero per fermare la reazione enzimatica e antibiotici per prevenire la contaminazione. Pellettare e lavare il campione più volte per rimuovere la maggior parte dei detriti.

Infine, posizionare il tubo sul ghiaccio per consentire la sedimentazione per gravità. I detriti, compresi i resti della cuticola o i grumi di cellule, si depositeranno, mentre le cellule dissociate rimarranno sospese nello strato superiore del terreno. Queste cellule possono essere utilizzate per colture a breve termine o per isolare specifiche popolazioni cellulari mediante FACS o immunoprecipitazione.

Nel protocollo di esempio, dissocieremo vermi transgenici che esprimono GFP nei neuroni di interesse per isolare e analizzare tali cellule.

- Dopo aver raccolto gli animali, centrifugarli a 1.600 volte g per cinque minuti. Rimuovere tutto il surnatante e risospendere i vermi in 1 millilitro di terreno M9. Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 1.600 volte g per cinque minuti per pellettare i vermi. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone SDS-DDT e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. I vermi dovrebbero ora apparire rugosi lungo il corpo se osservati al microscopio ottico.

Quindi, aggiungere 800 microlitri di tampone isolante ghiacciato e mescolare muovendo delicatamente il tubo. Centrifugare a 13.000 volte g e a 4 gradi Celsius per un minuto per pellettare i vermi. Rimuovere il surnatante e lavare con 1 millilitro di tampone isolante.

Ripetere questo processo di centrifugazione e lavaggio per un totale di cinque volte, assicurandosi di rimuovere con cura il tampone di isolamento ogni volta. Successivamente, aggiungere al pellet 100 microlitri di miscela di proteasi di Streptomyces griseus disciolta in tampone di isolamento.

Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Assicurarsi di applicare l'interruzione meccanica pipettando su e giù da 60 a 70 volte con la punta della micropipetta da 200 microlitri contro il fondo della provetta. Per determinare lo stadio della digestione, rimuovere da 1 a 5 microlitri della miscela per la digestione, lasciarla cadere su un vetrino e ispezionarla utilizzando un microscopio per colture tissutali.

Dopo cinque o sette minuti, i frammenti di verme dovrebbero avere una cuticola visibilmente ridotta e un impasto di cellule sarà facilmente visibile. Arresta la reazione aggiungendo 900 microlitri di terreno L15 di Leibovitz disponibile in commercio integrato con il 10% di FBS e penicillina-streptomicina.

Centrifugare a 10.000 volte g e a 4 gradi Celsius per 5 minuti per pellettare frammenti e celle isolati. Lavare le celle pellettate altre due volte con terreno integrato con L15 a freddo utilizzando 1 millilitro di terreno per lavaggio. Risospendere le cellule pellettate in 1 millilitro di terreno integrato con L15 e lasciare in ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, prendi lo strato superiore, che è di circa 700-800 microlitri, e trasferiscilo in una provetta da microcentrifuga. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per misurare la densità cellulare di 10-25 microlitri di cellule isolate.