Placcatura dell'RNAi per l'alimentazione di C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione del dsRNA bersaglio in E. coli

- In C. elegans, l'RNAi può essere indotto alimentando vermi batteri che esprimono RNA a doppio filamento o dsRNA da un plasmide di DNA ricombinante.

Per iniziare, coltivare HT115 coli resistente alla tetraciclina trasfettato con plasmide L4440 durante la notte su piastre di agar LB selettive contenenti tetraciclina e ampicillina, o il suo analogo funzionale carbenicillina. Oltre al DNA bersaglio, il plasmide contiene un gene per la resistenza all'ampicillina. Solo le colonie di batteri che ereditano il plasmide possono crescere in presenza di questi antibiotici.

Successivamente, raccogliere le colonie di batteri ed espanderle in mezzo LB liquido fino alla concentrazione desiderata. Per indurre l'espressione del dsRNA, trasferire la soluzione batterica su piastre di agar per nematodi preparate, o NGM, contenenti IPTG.

In questo sistema di espressione, l'IPTG imita il lattosio per inattivare il repressore lac che consente l'espressione della RNA polimerasi T7. Sul plasmide, l'espressione del DNA bersaglio è regolata da due promotori T7 convergenti. Di conseguenza, le sequenze senso e antisenso vengono trascritte portando all'espressione del dsRNA.

Infine, il verme utilizza le inform