Saggio dell'olfattometro a quattro vie: un metodo per valutare le risposte degli odori in Drosophila

- Un olfattometro a quattro vie è una camera chiusa con porte unidirezionali ad ogni angolo, attraverso la quale può erogare fino a quattro odori, creando quadranti con profili di odore distinti. Inizia un esperimento trasferendo le mosche sveglie nella camera. Evita l'anestesia, poiché ciò potrebbe influenzare il loro comportamento durante l'esperimento.

Esponi le mosche all'aria pulita e osserva i loro movimenti per assicurarti che nessun odoroso contamini l'olfattometro e influenzi il comportamento delle mosche. Quindi, preparare gli odoranti di prova in fiale separate e collegarli alla camera principale attraverso le porte unidirezionali. Esporre le mosche agli odori per un periodo predefinito, rimuovendo lo stimolo al termine della prova.

Le mosche tendono ad evitare i quadranti con odori repellenti mentre si spostano e si stabiliscono in quadranti con odori attraenti. Misura le risposte comportamentali delle mosche seguendo le loro posizioni nel tempo mentre esplorano l'olfattometro.

Nel seguente protocollo, utilizzeremo un olfattometro a quattro quadranti con un sistema di erogazione dell'aria per analizzare il comportamento della mosca in risposta al propionato di etile, un odorante repellente, e all'aceto di sidro di mele, che è attraente.

- Almeno cinque minuti prima, accendere il regolatore di temperatura e impostarlo a 25 gradi Celsius. Quindi, collegare le camere degli odori all'arena tramite un tubo di plastica. Controllare la portata d'aria in ogni quadrante dell'arena utilizzando un flussometro elettronico. Assicurati che il controllo e gli odori e i flussi d'aria funzionino entrambi a 100 millilitri al minuto.

- I moscerini sono molto sensibili al flusso d'aria ed è fondamentale che il flusso d'aria per ogni quadrante sia verificato prima di ogni esperimento.

- Ora, pulisci l'arena e le lastre di vetro usando etanolo al 70%. Pulisci tutte le parti due o tre volte e lasciale asciugare completamente all'aria prima di procedere. Quindi, fissa le lastre di vetro all'arena. Quindi, trasferisci le mosche nell'arena senza anestesia. Usando la gravità, lasciali entrare attraverso il foro in una delle lastre di vetro, quindi copri il foro con una rete circolare.

Ora, posiziona l'arena caricata al volo nella camera a tenuta di luce. Quindi, collega i quattro flussi d'aria di controllo a ciascun angolo dell'arena. Chiudi lo sportello della camera e lascia che le mosche si acclimatino al nuovo ambiente per 10-15 minuti.

Dopo il periodo di acclimatazione, eseguire un esperimento di controllo da 5 a 10 minuti in cui le mosche sono esposte a quattro flussi d'aria di controllo. Ora è essenziale analizzare immediatamente i dati. Se le mosche non sono distribuite uniformemente nell'arena, l'arena deve essere ripristinata.

- È fondamentale testare il comportamento delle mosche di controllo per pulire l'aria. In questo modo si verificherà rapidamente che tutte le condizioni di sfondo siano normali. Perdite di luce, squilibrio di temperatura, arena inclinata o contaminazione da odori possono causare problemi.

- Se necessario, scarta le mosche e pulisci di nuovo l'arena. Se si sospetta una contaminazione da odore, sostituire tutti i tubi. Continuare a ripetere il test di controllo con nuove coorti fino a quando gli animali non mostrano alcuna preferenza per nessuno dei quattro quadranti. Quindi, collegare la camera dell'odorizzante di prova alla configurazione utilizzando una valvola a tre vie, oppure ricollegare il tubo ed eseguire un esperimento di prova per 5-10 minuti. Per registrazioni sperimentali più lunghe, arrestare e riavviare rapidamente il programma di tracciamento ogni 20 minuti, altrimenti i file di dati saranno troppo grandi.

Tra un test e l'altro, scartare le mosche, pulire l'arena e le lastre di vetro con etanolo al 70% e sostituire i tubi di collegamento. Mantenere il flusso d'aria secca in modo da lavare continuamente il sistema. Per l'efficienza, è bene avere due arene in modo che la pulizia possa essere eseguita durante le corse.

- Se vengono eseguiti più esperimenti nello stesso giorno, prestare la massima attenzione per assicurarsi che non rimanga alcun odore nel sistema da una corsa precedente. Questo normalmente non è un problema con basse concentrazioni di odorizzante o con CO2. Ma per stimoli altamente concentrati, potrebbe essere necessario un intervallo fino a 24 ore tra le esecuzioni dell'esperimento.