0 visualizzazioni • 5:51 min. • April 30th, 2023
- Raccogli gli embrioni di Drosophila vivi e rimuovi i loro corioni non trasparenti. Quindi, su un vetrino coprioggetti, applicare una linea di colla eptanica, che è un adesivo a nastro disciolto in eptano liquido. Per essere in grado di maneggiare gli embrioni ora dechorionati, allineare accuratamente i campioni in fila sull'adesivo.
Trasferire il vetrino coprioggetti in una camera di disidratazione per essiccare parzialmente gli embrioni. Ciò impedirà la perdita citoplasmatica durante o dopo le iniezioni. Quindi, rimuovi il vetrino coprioggetti e copri gli embrioni con olio di alocarburi per evitare un'ulteriore disidratazione, pur consentendo all'ossigeno di diffondersi negli embrioni.
Per eseguire la microiniezione, utilizzare un sistema di microiniezione su un microscopio compatibile. Guardando attraverso i pezzi degli occhi, identifica sia gli embrioni che l'ago precaricato con la soluzione iniettabile. Aprire l'ago e assicurarsi che produca gocce di liquido consistenti e di dimensioni adeguate. Quindi, porta l'ago all'interno dell'embrione e inietta il volume appropriato. Estrarre l'ago e passare a quello successivo, ripetendo l'iniezione per gli embrioni rimanenti.
Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione della microiniezione di embrioni di Drosophila per studi di imaging dal vivo della divisione cellulare.
- Prima di installare il vetrino, prepara la colla eptanica srotolando il nastro biadesivo e mettendolo in una bottiglia da 100 millilitri. Aggiungere circa 50 millilitri di eptano, sigillare la bottiglia e farla oscillare per diversi giorni.
Prima di preparare gli embrioni, creare una camera di disidratazione in cui verranno inseriti gli embrioni prima dell'iniezione. Per fare questo, metti una parte di un piatto da 35 millimetri all'interno di una piastra di Petri da 100 millimetri per creare un "tavolo". Aggiungere la drierite, che è solfato di calcio anidro, intorno ad essa in modo che l'altezza della drierite non sia superiore al "tavolo" e coprire.
Per iniziare a preparare gli embrioni, raccoglieteli prima dalla gabbia di deposizione cambiando il piatto del succo d'uva con il lievito ogni ora. Gli embrioni devono essere sottoposti a imaging circa due ore dopo l'inizio della raccolta. Per preparare il vetrino coprioggetti, posizionarlo su un lato di un vetrino da microscopio e fissare i quattro angoli con del nastro adesivo, in modo che non si muova.
Usando un applicatore con punta di cotone, metti uno strato di colla eptano in una linea sul vetrino coprioggetti. La colla non deve essere viscosa e deve asciugarsi in pochi secondi. Se è troppo denso, aggiungi altro eptano.
Infine, metti un pezzo di nastro biadesivo sul vetrino accanto al vetrino coprioggetti. Con un pennello inumidito, prelevare con cura gli embrioni dalla piastra del succo d'uva e posizionarli sul nastro biadesivo sul vetrino.
Quindi, usa metà di una pinzetta per arrotolare gli embrioni sul nastro biadesivo fino a quando il corion non si apre. Raccogli l'embrione facendolo rotolare delicatamente sul corion, in modo che aderisca alla pinzetta, e posizionalo sulla colla eptanica sul vetrino coprioggetti con il lato lungo dell'embrione parallelo al lato lungo del vetrino coprioggetti.
Posizionare da 10 a 20 embrioni in una fila. Rimuovere il vetrino coprioggetti e metterlo nella camera di disidratazione per tre-otto minuti. Il tempo dipende dall'umidità locale e dalla quantità da iniettare. Quindi, posizionare il vetrino coprioggetti su una camera metallica con grasso sottovuoto. Infine, copri gli embrioni con olio di alocarburi per evitare un'ulteriore disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione.
Innanzitutto, trova gli embrioni con un obiettivo 16X. Allontana gli embrioni e trova l'ago senza spostare il piano focale. Centrare l'ago e spostarlo verso l'alto senza spostarlo in direzione X o Y.
Per aprire l'ago, inserire il bordo del vetrino coprioggetti nel campo visivo, ma non dove si troverà un ago, e abbassare l'ago sullo stesso piano focale. Con molta attenzione, muovi il vetrino coprioggetti finché non colpisce l'ago e lo rompe delicatamente. Sposta l'ago verso l'alto.
Ora mettete in vista gli embrioni. Abbassa l'ago nell'olio e assicurati di ottenere delle belle gocce di liquido dall'ago. Sposta costantemente l'embrione nell'ago, inietta una goccia nell'embrione e poi allontana l'embrione. Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, sono pronti per l'osservazione su un microscopio confocale con un obiettivo 60 o 100X.