Saggio con sonda termica locale: un metodo per valutare la nocicezione delle alte temperature nelle larve di Drosophila

- Per preparare le larve di Drosophila per un test con sonda termica, raccogliere gli animali dello stadio di sviluppo desiderato e trasferire le singole larve su una piastra di prova con un sottile film d'acqua. L'acqua permette alle larve di muoversi liberamente senza attaccarsi alla superficie della piastra.

Le larve di Drosophila rilevano stimoli termici nocivi attraverso neuroni sensoriali multidendritici nella loro epidermide, noti come nocicettori. Questi non si attivano fino a quando non viene raggiunta una certa soglia sensoriale, come le alte temperature potenzialmente dannose.

Impostare la sonda termica su una temperatura che superi questa soglia sensoriale e provochi l'accensione dei nocicettori. Premere delicatamente la punta della sonda contro la larva per applicare il calore. La larva risponderà alla temperatura nociva con comportamenti termo-nocicettivi, ritirandosi dalla sonda. Fermati quando la larva mostra un ruolo a 360 gradi lontano dalla sonda di calore, o quando è trascorso un tempo definito. Registrare il tempo di risposta.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione di un saggio con sonda termica localizzata su larve di Drosophila all'inizio del terzo stadio.

- Per prima cosa, preimpostare la temperatura della sonda termica sul set point desiderato. Usa un pennello o una pinza per trasferire delicatamente una singola larva su una piattaforma piana, assicurandoti che la lava sia coperta da un sottile strato d'acqua.

- Al fine di ridurre al minimo la variazione di pressione, nonché di garantire la corretta posizione e angolazione della sonda di calore, la pratica rende perfetti.

- Premere delicatamente la punta della sonda contro la larva al segmento A4, esercitando una leggera pressione con la punta a un angolo di circa 45 gradi tra la sonda e la superficie della larva. La pressione dovrebbe causare una leggera rientranza sulla superficie della larva e di solito sarà sufficiente per impedire la locomozione. Continuare a stimolare la larva fino a quando non viene mostrata una risposta di ritiro o fino a quando non viene raggiunto il limite di 20 secondi.

Le larve che rispondono in genere mostrano prima un comportamento preliminare di sollevamento della testa e della coda, seguito dal comportamento di ritiro di rotolamento di almeno 360 gradi. Una volta avviato il comportamento di prelievo, rilasciare il contatto con la sonda e registrare la latenza o il tempo impiegato per il prelievo. Se non si osserva alcun comportamento di astinenza entro 20 secondi, la larva non risponde.