Saggio del gradiente di temperatura: un metodo per testare la preferenza di temperatura nelle larve di Drosophila

- Per testare la preferenza di temperatura delle larve di Drosophila, creare un gradiente di temperatura riscaldando un lato di una piastra di analisi in alluminio e raffreddando l'altro. L'alluminio ha un'elevata conduttività termica, il che significa che il calore viene trasferito in modo efficiente, creando un gradiente di temperatura lineare stabile. Dopo che il sistema si è bilanciato, registrare le temperature sulla piastra in zone di temperatura della stessa dimensione, quindi caricare il centro della piastra con larve pulite.

Coprire l'intero sistema per eliminare le interferenze dovute alla luce intensa e iniziare la prova. Le larve si distribuiscono attraverso il gradiente, evitando zone avverse troppo calde o troppo fredde, e si insediano in zone con temperature favorevoli. Questo comportamento è chiamato termotassi. Per valutare la preferenza di temperatura delle larve, registrare il numero di animali in ciascuna zona di temperatura.

Nel protocollo di esempio, vedremo come impostare un gradiente di temperatura unidirezionale tra 18 e 28 gradi Celsius e come vengono gestite le larve durante il saggio.

- Per preparare un gradiente unidirezionale, creare innanzitutto un ambiente umido per il saggio. Posiziona due blocchi di alluminio collegati a bagnomaria separati su tovaglioli di carta bagnati a 10 centimetri di distanza. I bagni d'acqua devono essere riscaldati in anticipo. Quindi, preparare 100 millilitri di agarosio all'1% e aggiungere 25 millilitri a ciascuna piastra di analisi su una superficie piana. Una volta che l'agarosio si è solidificato, strofinare delicatamente la superficie con una spugna melaminica per rendere la superficie leggermente ruvida.

Quindi, per favorire un efficiente trasferimento della temperatura, riempire eventuali spazi tra i blocchi di alluminio nelle piastre del saggio con acqua erogata da un flacone spray. Ora, posiziona le piastre di analisi sui blocchi di alluminio e assicurati che le demarcazioni siano a 2 centimetri da entrambi i bordi per corrispondere esattamente ai bordi dei blocchi di alluminio.

Quindi, spruzzare una pellicola d'acqua sulla superficie delle piastre in modo che i gel non si secchino. Successivamente, coprire il sistema con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere da 5 a 10 minuti per consentire alla temperatura di stabilizzarsi. Quindi, controlla la temperatura superficiale sulla piastra in almeno 12 punti per assicurarti che ci sia una temperatura uniforme dappertutto, più o meno 2 gradi Celsius. Quindi, riposizionare il coperchio della scatola fino all'esecuzione del test.

Per prima cosa, rimuovi la scatola di cartone sopra il gel e controlla rapidamente la temperatura superficiale del gel. Se la superficie è asciutta, spruzzare una piccola quantità d'acqua sulla superficie. Se il gel è buono, caricare da 100 a 200 larve al centro di ogni piatto usando un piccolo pennello. Quindi, posizionare un coperchio su ciascuna piastra di analisi per intrappolare le larve e coprire la configurazione con una scatola di cartone per evitare l'esposizione alla luce. Il test è ora in corso.

Dopo 10-30 minuti, rimuovere la scatola di cartone e il coperchio della micropiastra. Quindi, fotografa le lastre dall'alto per registrare la posizione delle larve. Posiziona la scatola sopra la fotocamera per evitare riflessi sulla superficie del gel. Per ripulire la piastra, aspirare tutte le larve ovunque si siano disperse.

Ora, calcola la distribuzione percentuale delle larve in ciascuna zona utilizzando il software di analisi delle immagini. Tracciare delle linee ogni 2 centimetri in base alle demarcazioni sulla piastra di analisi e contare il numero di larve in ciascuna zona.

- Durante il conteggio, ignorare le larve distribuite in regioni a 0,5 centimetri da ciascun bordo. Lo spessore del gel e le condizioni di temperatura non sono uniformi vicino al bordo.