drosofila Activity Monitor (DAM): un metodo per misurare l'attività locomotoria nelle mosche

- Il Drosophila Activity Monitor, o DAM, contiene tubi di attività centrati dotati di cibo per mosche a un'estremità e di un chiudiporta permeabile all'aria all'altra. Questa configurazione ospita mosche singole durante esperimenti che durano diversi giorni o addirittura settimane.

Posiziona il DAM in un ambiente controllato come un'incubatrice con temperatura, umidità e ciclo di luce impostati. Condurre l'esperimento in una stanza buia e, se necessario, utilizzare una fonte di luce infrarossa per maneggiare il dispositivo, che a differenza della luce intensa, non influenza il sistema circadiano della mosca.

Per registrare l'attività locomotoria, collegare l'apparecchio a un sistema informatico che memorizza le letture dei rilevatori del DAM. L'elettronica del DAM rileva continuamente l'integrità di un raggio infrarosso che viene emesso attraverso il punto medio di ciascun tubo e carica periodicamente i dati sul sistema informatico.

Mentre la mosca cammina avanti e indietro all'interno del tubo, attraversa il raggio infrarosso. Queste interruzioni vengono conteggiate dal DAM nel tempo per ogni tubo e servono come misura dell'attività delle mosche.

Nel seguente protocollo, utilizzeremo il sistema DAM per studiare i ritmi circadiani nei maschi adulti di Drosophila.

- Prima di caricare le mosche nei tubi di attività, accendi le incubatrici che verranno utilizzate per ospitare i monitor di attività. Regolare la temperatura utilizzando i comandi dell'incubatrice e impostare il regime luce/buio utilizzando il controller di luce del sistema DAM o il sistema di controllo della luce dell'incubatrice, in base al progetto sperimentale desiderato.

Quindi, anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Quindi, usando un pennello fine, trasferisci delicatamente una singola mosca in un tubo di attività. Afferra il centro di un singolo pezzo di filo che è di circa mezzo pollice con una pinza fine e inserisci il filo nell'estremità non alimentare del tubo di attività per tappare l'apertura e impedire alla mosca di fuoriuscire durante l'esperimento, consentendo allo stesso tempo il flusso d'aria nel tubo.

Tenere il tubo appoggiato su un lato fino a quando la mosca non si risveglia per evitare che la mosca si attacchi al cibo. Inserire i tubi nei monitor di attività. Con il modello più recente e compatto dei monitor TriKinetics, è necessario tenere i tubi in posizione con elastici per garantire che il raggio infrarosso passi il tubo in posizione centrale.

Infine, inserire i monitor di attività nelle incubatrici e collegarli al sistema di raccolta dati tramite i cavi telefonici. Verificare, utilizzando il software di raccolta del sistema DAM, che tutti i monitor siano collegati correttamente e che i dati vengano raccolti da ciascuno di essi.

Ora che le mosche sono state caricate nei tubi di attività e il sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria è pronto, i dati possono essere registrati. Le mosche vengono sincronizzate e trascinate esponendole alla luce/buio desiderata, o LD, e al regime di temperatura per due o cinque giorni interi. La condizione di trascinamento più comunemente usata è un ciclo luce/buio di 12 ore di luce/12 ore di buio a 25 gradi Celsius.

Per lo studio dei ritmi circadiani relativi a questo protocollo, il tempo in cui le luci si accendono nell'incubatrice è definito come tempo zeitgeber 0 e tutti gli altri tempi sono relativi a quel valore. In condizioni standard di LD 12:12, la Drosophila melanogaster wild type mostra tipicamente due periodi di attività; uno centrato intorno a ZT0, chiamato picco mattutino, e un altro intorno a ZT12, chiamato picco serale.

I ritmi dell'attività locomotoria a corsa libera sono misurati in condizioni di buio e temperatura costanti dopo il periodo di allenamento. L'impostazione del ciclo di luce può essere modificata in qualsiasi momento nella fase di buio dell'ultimo giorno di LD, in modo tale che il giorno successivo dell'esperimento rappresenti il primo giorno di DD. Sette giorni di raccolta dei dati DD sono sufficienti per calcolare il periodo circadiano e l'ampiezza o la forza del ritmo delle mosche.

In generale, è necessaria una dimensione del campione di almeno 16 mosche per ottenere periodi di corsa libera affidabili per un particolare genotipo. Alla conclusione dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti utilizzando il software del sistema DAM vengono scaricati su un dispositivo di archiviazione dati portatile, ad esempio una chiavetta USB.

I dati binari grezzi vengono elaborati utilizzando DAM Filescan102X e sommati in intervalli di 15 e 30 minuti durante l'analisi dei parametri circadiani o in intervalli da 1 a 5 minuti durante l'analisi dei parametri di sospensione/riposo. Attualmente, cinque minuti contigui di inattività è la definizione standard di sonno/riposo in Drosophila.