Preparazione del cuore di Drosophila: una tecnica per studiare la fisiologia del cuore nel moscerino adulto

- A differenza dei vertebrati, il cuore della Drosophila fa parte di un sistema circolatorio aperto. Il cuore di un moscerino adulto è una struttura tubolare costruita da cardiomiociti che è collegata all'epidermide da muscoli alari e incorporata nella matrice extracellulare. La camera cardiaca si trova all'estremità posteriore del moscerino e pompa l'emolinfa nell'aorta da cui fluisce nella cavità del corpo aperto.

Negli insetti, l'emolinfa funge sia da sangue che da liquido interstiziale, trasportando sostanze nutritive, molecole di segnalazione e cellule immunitarie. Ulteriori punti di riferimento del cuore includono gli osti, che sono aperture lungo il tubo, e le valvole intracardiache. Le cellule pericardiche sono localizzate lungo il tubo cardiaco e fanno parte del sistema escretore del moscerino.

In una preparazione cardiaca sperimentale, l'emolinfa artificiale imita le condizioni fisiologiche per preservare la funzione dei tessuti. Sebbene l'emolinfa naturale non sia responsabile dello scambio gassoso, l'emolinfa artificiale deve essere ben ossigenata per sostituire la mancanza di un sistema tracheale funzionale. Nell'esperimento seguente, dimostriamo una preparazione cardiaca semi-intatta da un moscerino adulto per l'imaging dal vivo o l'elettrofisiologia.

- Prima di iniziare, prepariamo una soluzione di emolinfa artificiale. Questa soluzione contiene saccarosio e trealosio, che devono essere aggiunti all'emolinfa artificiale da soluzioni madre refrigerate appena prima dell'uso per prevenire la contaminazione batterica. Portare l'emolinfa artificiale a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione facendo gorgogliare aria per almeno 15 minuti.

Successivamente, estrarre diversi capillari sottili utilizzando un estrattore per pipette standard, che sarà necessario per la rimozione dei corpi adiposi nel moscerino.

Una volta che tutto è stato preparato, le mosche adulte devono essere anestetizzate. Questo può essere fatto utilizzando una breve esposizione al pisolino al volo per due o cinque minuti, ma fai attenzione a non lasciare le mosche nel pisolino al volo per più di cinque minuti. L'esposizione a breve termine al freddo può essere utilizzata anche per anestetizzare le mosche, ma l'anidride carbonica non è raccomandata poiché ha effetti più duraturi sulla frequenza cardiaca e sulla ritmicità.

Successivamente, le mosche anestetizzate vengono posizionate, con la parte dorsale rivolta verso il basso, in una capsula di Petri rivestita con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobica nelle ali e nel corpo dovrebbe aderire in modo reversibile alla gelatina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Un taglio iniziale viene eseguito utilizzando un paio di forbici a molla curve. Questo viene fatto posizionando le lame delle forbici sotto le gambe della mosca e inclinate verso il basso verso la superficie dorsale del torace vicino al collo.

La testa, il cordone nervoso ventrale e le gambe vengono rimossi con un unico taglio. Una volta tagliato, il preparato viene poi immerso nella soluzione di emolinfa artificiale ossigenata. Usando le forbici a molla, la punta posteriore dell'addome, che è composta dai segmenti addominali 7 e 8, viene rimossa con un unico taglio. Questo fornisce l'accesso per eseguire tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a recidere la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale.

Inserisci le lame delle forbici nella piccola apertura nella punta dell'addome e taglia la cuticola lateralmente. Questo libera un bordo della cuticola ventrale. Afferra il lembo con una pinza e fai un taglio simile lungo il bordo laterale opposto dell'addome. Il lembo liberato della cuticola addominale ventrale può ora essere rimosso.

L'intestino e altri organi addominali di solito possono essere rimossi come un'unica massa usando una pinza da gioielliere e uno strattone delicato. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco pulsante, che è ancora attaccato alla cuticola dorsale da piccoli muscoli alari ed è circondato da corpi grassi. I capillari estratti vengono inseriti in un tubo di plastica da 1/16 di pollice collegato a una fonte di vuoto. La forza di aspirazione è proporzionale al diametro del puntale, pertanto non è consentito l'uso di pipette con puntali di diametro superiore a 40 micron.

Una volta installato, questo sistema di aspirazione viene utilizzato per aspirare il grasso in eccesso intorno al tubo cardiaco. Può essere utilizzato anche per rimuovere le bolle d'aria che si accumulano intorno alla cuticola ed eventuali detriti. Bisogna prestare la massima attenzione per evitare di toccare il cuore stesso e, poiché la parte posteriore del cuore è molto fragile, quella regione dovrebbe essere evitata del tutto. Il tubo cardiaco adulto di Drosophila è ora esposto e dovrebbe battere.

Se necessario, la cuticola e il cuore attaccato possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla vaselina e pressandola con cura, evitando nuovamente qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto, la soluzione che bagna il preparato deve essere sostituita con emolinfa artificiale fresca. Questo preparato deve essere lasciato equilibrare per 20-30 minuti con ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione. Se il preparato deve essere mantenuto per più di 60 minuti, deve essere nuovamente perfuso con emolinfa artificiale fresca. Questo preparato è ora pronto per essere utilizzato per la registrazione ottica e può essere utilizzato anche per la registrazione elettrofisiologica o per manipolazioni istologiche.