C. elegans Saggio della chemiotassi: un metodo per testare la chemiosensazione nei vermi

- Per dare un senso alle condizioni incontrate e rispondere ad esse di conseguenza, il verme C. elegans ha, tra l'altro, un sistema chemiosensoriale altamente sviluppato in grado di rilevare un'ampia varietà di sostanze chimiche diverse.

I neuroni sensoriali della testa, dell'anfido e dei neuroni labiali interni, così come i neuroni della coda, i neuroni fasmidi, sono esposti direttamente o indirettamente attraverso la cuticola alle condizioni esterne. Questi neuroni chemiosensoriali codificano le informazioni rilevanti utilizzate dal verme per produrre una risposta comportamentale appropriata: un comportamento chiamato chemiotassi.

Per testare la risposta chemiotattica agli odori volatili o agli stimoli gustativi idrosolubili, isolare i vermi dello stadio di sviluppo desiderato ed esporli alla sostanza chimica in esame su un'arena sperimentale precedentemente preparata. Quando esposto a sostanze chimiche favorevoli come quelle prodotte da una fonte alimentare batterica, C. elegans mostra una chemiotassi positiva verso la fonte.

Al contrario, quando esposto a sostanze chimiche meno favorevoli o tossiche come i metalli pesanti, il verme mostra una chemiotassi negativa, evitando la sostanza chimica. Quindi, i mutanti olfattivi o gustativi non riescono a evitare le sostanze chimiche avverse e rimangono in condizioni sfavorevoli a differenza degli animali di tipo selvatico che evitano la condizione avversiva.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione di un test di chemiotassi, che verifica l'avversione del verme al rame.

- Dopo l'incubazione notturna, rimuovere le piastre dall'incubatore e, utilizzando la parte inferiore contrassegnata della piastra come guida, pipettare 100 microlitri di soluzione di rame 0,5 molare e due solfato appena preparata sul bordo dell'agar per creare una barriera esterna di rame. Pipettare 25 microlitri della soluzione di rame a due solfati per creare una barriera mediana.

Assicurarsi che la soluzione di rame e due solfato non entri in contatto con il cerotto batterico e lasciare asciugare la soluzione di rame sulla piastra. Controllare la secchezza ogni cinque minuti dopo il trasferimento con un fazzoletto di laboratorio tamponando leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per distinguerla.

Immediatamente prima del saggio, trasferire gli organismi sperimentali su una piastra di agar priva di batteri e lasciare che i nematodi si muovano liberamente per un minuto per rimuovere i batteri in eccesso.

Quindi, pipettare 1 millilitro di M9 sulla piastra con giovani adulti che sono stati trasferiti 24 ore prima per lavare i vermi in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare i nematodi a 3.000 volte g per un minuto.

I vermi dovrebbero formare un pellet sul fondo del tubo. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellet della vite senza fine. Aggiungere 1 millilitro di soluzione M9 al pellet di vermi. Capovolgere il tubo per mescolare i vermi con la soluzione.

Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere l'operazione per un totale di cinque volte. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a quando non vengono erogati 100 microlitri di soluzione M9 e rimane il pellet di verme. Trasferire immediatamente le viti senza fine dalla soluzione una volta completate le fasi di lavaggio.

Pipettare 20 microlitri di pellet di verme dal fondo della provetta sulla metà priva di batteri della piastra del test. Assicurarsi che 10 vermi siano trasferiti sulla piastra di analisi e che non siano presenti alimenti contaminanti. Nessun batterio deve essere trasferito sui piatti da gara in rame.

Rimuovere la soluzione M9 in eccesso dai nematodi con un fazzoletto di laboratorio entro un minuto. Assicurarsi che la soluzione M9 non entri in contatto con la soluzione di due solfato di rame e che i vermi e la superficie dell'agar rimangano intatti. Scartare i vermi che sono stati rimossi accidentalmente con il tessuto di laboratorio.

Una volta che la soluzione M9 è stata rimossa e tutti i vermi hanno iniziato i modelli locomotori non liquidi, cioè quando hanno smesso di dimenarsi, avviare il cronometro del saggio. Se sono stati accidentalmente inclusi vermi extra, rimuoverli raccogliendoli con olio di alocarburi per assicurarsi che non vengano aggiunti batteri alla piastra.

Controllare le piastre di analisi ogni 30 minuti. Per le piastre di analisi con patch batteriche, assegnare un punteggio positivo agli organismi che hanno raggiunto il patch di cibo in un periodo di quattro ore. Per le piastre di controllo negative, valutare positivamente gli organismi che hanno attraversato la barriera.