C. elegans Tracciamento del movimento: un metodo per valutare la locomozione nei vermi

- Per valutare la locomozione in C. elegans, utilizzare una telecamera per registrare il movimento dei vermi su una piastra di agar, garantendo un'illuminazione uniforme della piastra durante la registrazione. Per limitare il movimento dei vermi attorno alla piastra, utilizzare anelli di rame. Il rame è avverso a C. elegans, quindi i vermi sono rinchiusi all'interno degli anelli.

Posiziona diversi anelli di rame su una piastra per tracciare contemporaneamente le viti senza fine in ciascun anello. Ciò consente di effettuare la valutazione degli animali di controllo e da esperimento in condizioni identiche, riducendo la variabilità giornaliera e consentendo confronti fianco a fianco. Registra il movimento dei vermi a intervalli di tempo prestabiliti e utilizza il software del computer per analizzare le caratteristiche del comportamento della locomotiva, come la velocità di movimento e la distanza percorsa.

Nell'esempio di protocollo, vedremo una dimostrazione di un saggio di tracciamento del movimento che verifica gli effetti dell'alcol sulla velocità di locomozione del verme.

- Per iniziare, prenditi due minuti o meno per trasferire 10 vermi da ciascun gruppo sperimentale al centro di un anello di rame su una piastra di acclimatazione. Questa è una piastra senza etanolo. Evita di trasferire il cibo con i vermi in quanto ridurrà il loro movimento. Evita anche di danneggiare la superficie dell'agar perché i vermi si insinuano. Registrare il tempo di caricamento sulla lastra e assicurarsi di scaglionare il trasferimento dei vermi su ciascuna lastra di oltre due minuti, in modo che ogni lastra possa essere filmata individualmente all'intervallo di tempo appropriato.

Lasciare incubare ogni piastra di acclimatazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, trasferire i vermi sulla piastra di analisi, seguendo l'ordine utilizzato per posizionare i vermi sulla piastra di acclimatazione. Usando un plettro per vermi appiattito a bordo sottile senza batteri, raccogli i vermi sopra il piccone appiattito usando un movimento di raccolta. Quindi, sigillare la piastra con una pellicola di laboratorio per ridurre al minimo la perdita di etanolo durante la vaporizzazione.

- La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questa fase è molto importante, perché gli animali trasferiti saranno esposti all'etanolo più a lungo. Quindi è una buona idea ruotare quali ceppi vengono posizionati per primi sulla piastra tra le repliche sperimentali.

- Per filmare i vermi è necessario un microscopio con videocamera ad alta risoluzione. Anche l'illuminazione, ad esempio da una retroilluminazione quadrata da tre pollici, è fondamentale per l'analisi. Quindi, per mantenere il contrasto, visualizzare il supporto della lastra con il lato rivolto verso l'alto.

Prepara il software di analisi delle immagini per acquisire filmati time-lapse a 120 fotogrammi, 12 bit, in scala di grigi in un fotogramma al secondo. Per ridurre le dimensioni del file di output, pur mantenendo una risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzate una modalità di binning due per due.

Ora registra filmati di due minuti da ogni lastra, 10 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati su quella lastra. Quindi fai una seconda registrazione di due minuti, 30 minuti dopo che i vermi sono stati messi sulla lastra. Per questa dimostrazione viene utilizzato il software Image-Pro Plus, in quanto un'ampia varietà di altri software può essere adattata alla tecnica. Analizza i filmati come segmenti di due minuti.

Per prima cosa applica un filtro alle immagini che appiattisce lo sfondo e migliora il contrasto degli oggetti vermi. Nel menu, seleziona Elabora, quindi Filtri, quindi Miglioramento e infine Appiattisci. Imposta il parametro per uno sfondo scuro e una larghezza di 20 Pix.

Ora, analizza la locomozione degli animali in ogni anello separatamente con una regione circolare di interesse che si sovrappone all'anello di rame. Identificare e tracciare i vermi con il comando Traccia oggetti nel sottomenu Misura.

Nella finestra Tabella dati di rilevamento, utilizzare il pulsante Opzioni di rilevamento per consentire l'esclusione di tracce specifiche e per limitare eventuali artefatti sperimentali. Nella scheda Tracciamento automatico, impostate i parametri della traccia su un limite di velocità di 400 micron per fotogramma. Impostare il limite di accelerazione su Automatico.

Impostate la lunghezza totale minima della traccia su 400 micron e impostate il tipo di movimento predominante su Caotico. Quindi, sotto il parametro Traccia, impostate gli oggetti in modo che le tracce parziali abbiano una lunghezza minima di 21 fotogrammi e una profondità di proiezione di inseguimento di un fotogramma.

Ora, per avviare il processo di tracciamento, fai prima clic sul pulsante della funzione Trova tutte le tracce automaticamente. Vengono visualizzate la finestra di dialogo Opzioni conteggio/dimensione e la finestra di dialogo Tracciamento. Selezionare l'opzione Manuale per la selezione dell'intervallo di intensità nella finestra di dialogo Conteggio/Dimensione. In questo modo si ottiene un passaggio di soglia importante. Quindi regola i cursori "Soglia intensità" per creare un intervallo inclusivo che evidenzia gli oggetti scuri. Un buon punto di partenza sulla scala è compreso tra 0 e 1.500.

Ora applica un filtro di dimensione per escludere gli oggetti più grandi o più piccoli di un singolo worm. Vai al menu Misura, quindi seleziona il sottomenu Misurazione. Viene visualizzata la finestra di dialogo Opzioni conteggio/dimensione. Lì, imposta l'intervallo dell'area da 28.000 a 120.000 micron quadrati. E imposta l'intervallo perimetrale da 600 a 2.500 micron. Apportare modifiche a questi parametri quando si utilizzano vermi di dimensioni anomale.

Ora, completa il processo di tracciamento facendo clic su Continua nella finestra di dialogo di tracciamento. Ricontrolla che l'output segua le tracce con il filmato. Assicurati che ogni worm sia rappresentato a meno che non ci sia un motivo chiaro per filtrarlo. Quindi, eliminare manualmente le tracce prodotte da oggetti non worm.

Quindi, calcola la velocità di ogni verme facendo la media della distanza percorsa tra ogni fotogramma o ogni secondo e crea una velocità media per le tracce in ogni popolazione. Considera questa media finale come un punto campione per l'analisi statistica dell'esperimento.