Imaging del calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans vivo

- Posizionare un verme transgenico che esprime GCaMP, una proteina sensibile al calcio, in una camera di imaging insieme al cibo batterico per il verme. Quindi sigillare la capsula con il coperchio e la pellicola da laboratorio per evitare l'evaporazione. Osservalo con un microscopio composto dotato di epifluorescenza ad ampio campo. Registra immagini time lapse dei vermi per monitorare il loro comportamento e catturare la fluorescenza utilizzando il software di imaging.

I vermi transgenici esprimono una proteina sensore GCaMP sotto il controllo di un promotore che guida l'espressione di GCaMP in un neurone specifico. Quando quel neurone viene attivato, spara un potenziale d'azione, che depolarizza la membrana plasmatica. Dopo la depolarizzazione, i canali del calcio voltaggio-dipendenti si aprono nella membrana plasmatica. Ciò provoca un afflusso di ioni calcio nella cellula, con conseguente eccitazione neuronale.

GCaMP nel neurone eccitato lega gli ioni calcio. Ciò provoca la fluorescenza di GCaMP quando i vermi vengono ripresi con una luce di eccitazione a fluorescenza a bassa intensità. Nel protocollo di esempio, utilizzeremo l'imaging del calcio per visualizzare l'attività dell'interneurone AVA in C. elegans transgenico in microcamere di agarosio.

- L'imaging del calcio viene eseguito su un microscopio composto attrezzato per l'epifluorescenza ad ampio campo. Per limitare l'esposizione alla luce, utilizzare un segnale logico transistor-transistor che attiva un LED per illuminare il campione nello stesso momento in cui la fotocamera registra un fotogramma.

Esegui un filmato a raffica per 24 ore che riproduce ogni worm ogni 15-30 minuti. Innanzitutto, registrare 20 secondi con DIC, poi 20 secondi con fluorescenza GFP e, infine, un'immagine del segnale mKate2 per controllare i livelli di espressione.

Per l'ispezione visiva dei dati, utilizzare una mappa a falsi colori per migliorare la visibilità di piccole variazioni nell'intensità della fluorescenza. Infine, eseguire l'analisi dei dati sul calcio utilizzando le procedure standard.