JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 3:21 min • April 30th, 2023
- Per iniziare, trasferisci i giovani vermi adulti su un tampone di agarosio fresco su un vetrino. Quindi aggiungere alcune gocce di soluzione di levamisolo da 12 millimolari per paralizzare i vermi. Coprite i vermi con un vetrino coprioggetti e aspettate qualche minuto. Posizionare il vetrino sotto un microscopio confocale a disco rotante e mettere a fuoco la superficie laterale più esterna del verme.
L'epidermide di un verme adulto è una sottile struttura a strato singolo costituita da sincizi multinucleati che derivano da eventi di fusione cellulare. La superficie apicale dell'epidermide secerne una cuticola collagenica flessibile, mentre la superficie basale è ricoperta da un sottile strato di matrice extracellulare chiamato lamina basale.
Successivamente, avvolgere la superficie apicale dell'epidermide con un laser. Il citoplasma dalle cellule danneggiate può fuoriuscire, apparendo come una bolla nel sito della ferita.
L'irradiazione laser ha un vantaggio rispetto ad altre tecniche, come l'avvolgimento dell'ago, in quanto provoca una rottura localizzata della cuticola e delle cellule epidermiche, senza danneggiare i tessuti interni. Nel protocollo di esempio, vedremo il processo di ferimento laser in C. elegans.
- Per ferire con precisione i nematodi, questo protocollo utilizza un laser a femtosecondi collegato al microscopio confocale a disco rotante. Anche le scansioni lineari o a punti con laser a femtosecondi, come quelle dei microscopi a due fotoni, dovrebbero essere sufficienti.
- Inizia raccogliendo 10 giovani adulti su un pad agar. Paralizzarli in una goccia da due microlitri di soluzione di levamisolo da 12 millimolari. Quindi coprili con un vetrino coprioggetti e attendi qualche minuto mentre si paralizzano.
- È essenziale che un animale sia completamente paralizzato. 12 millimolari di levamisolo non influenzeranno la risposta della ferita. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri metodi di immobilizzazione.
- Assicurarsi che la potenza del laser a femtosecondi sia impostata su 140 milliwatt, misurata prima dell'obiettivo, e che la frequenza di ripetizione del laser sia di 80 megahertz. Ora, localizza i vermi sotto un microscopio confocale a disco rotante. Utilizzando un obiettivo 100x con un'elevata apertura numerica, mettere a fuoco l'epidermide sinciziale laterale anteriore o posteriore del verme bersaglio.
Concentrandosi sulla superficie apicale della cellula epidermica, far brillare il laser per due impulsi di 200 millisecondi separati da 20 millisecondi. Questo dovrebbe essere sufficiente per ferire l'epidermide. Aspetta un momento e osserva l'interruzione locale del citoplasma, che apparirà come gorgogliamento. Se è presente un marcatore fluorescente, si può osservare uno sbiancamento localizzato.