Alimentazione FITC-destrano: un metodo per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 2:56 min • April 30th, 2023
- C. elegans è utilizzato come modello sperimentale di infezione da patogeni intestinali che causano la malattia, in parte, interrompendo la barriera intestinale, aumentandone la permeabilità. Per quantificare l'integrità della barriera dopo l'esposizione a un batterio o a un composto chimico di interesse, raccogliere i vermi lavandoli via dalle piastre.
Successivamente, posiziona questi vermi su piastre di agar con cibo etichettato composto da E. coli ucciso a caldo mescolato con FITC-destrano, un polisaccaride ad alto peso molecolare con un'etichetta fluorescente.
Consenti ai vermi di mangiare i batteri etichettati. Quelli con barriere intestinali intatte elimineranno rapidamente il cibo, mentre nei vermi con intestino più permeabile, il marcatore fluorescente penetrerà oltre il lume dell'organo.
Trasferisci i vermi in una soluzione di formaldeide per fissare gli animali. Dopo 1 o 2 minuti, sostituire la formaldeide con un mezzo di montaggio.
Infine, visualizza i vermi mediante microscopia a fluorescenza. Si noti che i granuli intestinali di C. elegans sono autofluorescenti, quindi ci sarà un segnale di fondo. Ma nel complesso, una maggiore fluorescenza intestinale indica una maggiore permeabilità.
Nel protocollo di esempio, valuteremo l'effetto del trattamento con la biomolecola DIM sulla permeabilità intestinale di vermi infettati da batteri patogeni Pseudomonas aeruginosa.
- Preparare le piastre integrate con FITC destrano mescolando 2 millilitri di E. coli inattivato termicamente con 4 milligrammi di FITC-destrano. Aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascuna delle 20 piastre di agar NGM fresche e lasciare asciugare le piastre per un'ora su un banco da laboratorio pulito. Dopo 48 ore di trattamento, lavare i vermi con S Buffer. Trasferirli in piastre integrate con FITC-destrano e in piastre NGM senza FITC-destrano e incubare le piastre per una notte.
Il giorno successivo, lavare i vermi con S Buffer e lasciarli strisciare nella piastra di agar NGM fresca per un'ora. Aggiungere 50 microlitri di formaldeide al 4% in ciascun pozzetto di una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti e trasferire circa 50 vermi in ciascun pozzetto. Dopo 1 o 2 minuti, rimuovere tutta la formaldeide e aggiungere 100 microlitri di terreno di montaggio in ogni pozzetto.
- La formaldeide è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiata con cura.
Panoramica
Questo studio utilizza C. elegans come organismo modello per indagare la permeabilità intestinale in risposta a infezioni patogene. La metodologia prevede la quantificazione dell'integrità della barriera dopo l'esposizione a batteri o composti chimici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Biologia sperimentale
Sfondo
- C. elegans funge da modello per lo studio delle infezioni intestinali.
- I patogeni possono alterare la barriera intestinale, aumentandone la permeabilità.
- I marcatori fluorescenti consentono di visualizzare l'integrità intestinale.
- Comprendere la permeabilità può contribuire allo sviluppo di trattamenti per le infezioni.
Scopo dello studio
- Valutare l'effetto del DIM sulla permeabilità intestinale in C. elegans.
- Quantificare l'impatto di Pseudomonas aeruginosa patogeno sull'integrità della barriera.
- Stabilire un metodo affidabile per misurare la permeabilità intestinale.
Metodi Utilizzati
- I vermi vengono raccolti e posizionati su piastre di agar con dextrano-FITC.
- La permeabilità intestinale viene valutata misurando la fluorescenza dopo il trattamento.
- I vermi vengono fissati in formaldeide e analizzati mediante microscopia a fluorescenza.
- I gruppi di controllo e sperimentali vengono confrontati per valutare gli effetti del trattamento.
Risultati principali
- I vermi con barriere intatte mostrano un rapido chiarimento del cibo fluorescente.
- Un aumento della fluorescenza intestinale indica una permeabilità maggiore.
- Il trattamento con DIM influisce sulla permeabilità dei vermi infetti.
- I risultati dimostrano l'utilità di C. elegans nello studio della salute intestinale.
Conclusioni
- C. elegans è un modello efficace per lo studio delle infezioni intestinali.
- I saggi fluorescenti forniscono informazioni preziose sull'integrità della barriera.
- Ulteriori ricerche potrebbero portare a trattamenti migliorati per le malattie intestinali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione della permeabilità intestinale in C. elegans mediante somministrazione orale di dextrano-FITC fornisce un indicatore solido e scalabile dell'integrità della barriera in risposta a esposizioni batteriche o chimiche. Questo saggio consente una riduzione precoce dei rischi meccanicistici e supporta una valutazione predittiva affidabile della validazione del bersaglio per la funzione della barriera intestinale. Il metodo è particolarmente indicato per la selezione di portafogli in cui la permeabilità intestinale rappresenta un parametro traslazionale chiave.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta dei meccanismi di alterazione della barriera intestinale indotti da patogeni o composti.
- Consente la validazione funzionale di bersagli in vie di regolazione dell'integrità epiteliale.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione di bersagli che influenzano la permeabilità intestinale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un'indicazione quantitativa e riproducibile della funzione della barriera intestinale in un organismo vivo.
- Standardizza la valut inflammata degli effetti di composti o batteri sulla permeabilità ai fini di campagne di screening.
- Consente scalabilità e riutilizzo della piattaforma per la valutazione comparativa di interventi multipli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a endpoint rilevanti per la malattia nei modelli di disfunzione della barriera intestinale.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di agenti modulatori della barriera.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento fornendo evidenze meccanicistiche della modulazione della barriera.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio di alimentazione con FITC-dextrano si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica nella ricerca sulla barriera intestinale, supportando sia la verifica delle ipotesi che l'identificazione di composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Quantifica i cambiamenti nell'integrità della barriera a seguito dell'esposizione a batteri o composti candidati.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi basati sulla fluorescenza per il confronto tra diverse condizioni.
- Analisi: Consente l'analisi statistica delle differenze di permeabilità tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Offre un modello per valutare interventi mirati alla funzione della barriera epiteliale.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e adattabile per diversi studi sulla barriera intestinale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla barriera intestinale.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità degli saggi tra diversi studi.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale riducendo i rischi associati a target in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati modulatori della barriera corretta in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione di C. elegans e nella microscopia a fluorescenza.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per l'acquisizione di immagini e strumenti di analisi quantitativa.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per ottenere misurazioni della permeabilità riproducibili.
- È adattabile a diverse esposizioni batteriche o chimiche nel modello C. elegans.
- Il fondo autofluorescente nei granuli intestinali deve essere considerato nell'analisi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026