0 visualizzazioni • 3:40 min. • April 30th, 2023
- La creazione di array di DNA extracromosomico mediante microiniezione, il metodo più semplice per generare ceppi di vermi transgenici, produce elementi genetici che non vengono trasmessi stabilmente durante la divisione cellulare e, quindi, mostrano tassi di ereditarietà e livelli di espressione variabili. L'obiettivo dell'integrazione dell'array in un cromosoma è quello di ridurre questa instabilità e variabilità genetica.
Per fare ciò, inizia con una popolazione sincronizzata per età di vermi transgenici L4, che trasportano un array extracromosomico precedentemente introdotto mediante microiniezione e consentono loro di crescere in adulti gravidi. Trasferisci questi adulti in nuovi piatti e lascia che depongano le uova fino a quando non ci sono almeno 30 uova su ogni piatto. Togliete gli adulti e lasciate che le uova crescano fino a raggiungere lo stadio L4. Quindi, irradiare i vermi con luce UV. Ciò provoca rotture casuali a doppio filamento nel DNA genomico in cui il meccanismo di riparazione del DNA dei vermi può incorporare arbitrariamente l'array.
Dopo un periodo di recupero notturno, conta il numero di vermi sopravvissuti. Una piccola percentuale di vermi morti indica un'irradiazione efficiente. Osservare le generazioni successive per isolare le linee transgeniche integrate omozigoti. Nel protocollo di esempio, integreremo un array extracromosomico ad alta velocità di trasmissione che trasporta un marcatore di co-iniezione fluorescente espresso nella faringe.
- Valutare la velocità di trasmissione della linea transgenica da integrare. Per ogni linea transgenica, prelevare 10 adulti gravidi fluorescenti su 10 piastre di coltura separate sotto uno stereoscopio fluorescente. Coltivare gli animali in un'incubatrice per vermi posta ad una temperatura permissiva alla riproduzione del background genetico.
Monitorare la progenie ogni giorno per valutare in quale stadio di sviluppo è espresso il marcatore di co-iniezione e può essere meglio osservato. Utilizzando la stereoscopia fluorescente, valutare la velocità di trasmissione della progenie determinando la percentuale di progenie fluorescente. Per l'integrazione transgenica, selezionare la linea transgenica con la più alta velocità di trasmissione.
Ottenere una popolazione di animali transgenici sincronizzati allo stadio larvale L4 per l'integrazione. Scegli 30 adulti gravidi fluorescenti su cinque piastre di coltura. Dopo che i vermi hanno deposto le uova per tre o quattro ore a 15 gradi Celsius, verificare la presenza di almeno 30 uova per piatto, quindi eliminare gli adulti dai piatti.
Alleva gli animali in un'incubatrice per vermi fino a quando la progenie raggiunge lo stadio larvale L4. Posizionare ogni piastra contenente da 15 a 20 animali transgenici fluorescenti L4 in un reticolante UV con i coperchi rimossi. Irradia i vermi.
Per il recupero, incubare i vermi irradiati durante la notte a 15 gradi Celsius. Controlla il numero di animali vivi. Nelle nostre mani, un tasso di sopravvivenza compreso tra l'80% e il 90% è adattivo per un'irradiazione efficiente. Far crescere gli animali irradiati a una temperatura compresa tra 15 e 25 gradi Celsius fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo, consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di co-iniezione.