Valutazione dei focolai di danno al DNA: identificare i focolai di danno al DNA indotti dalle radiazioni in una linea cellulare tumorale utilizzando la colorazione in immunofluorescenza

- Le radiazioni ionizzanti inducono diversi tipi di danni al DNA, come le rotture a singolo filamento o SSB e le rotture a doppio filamento o DSB. Le rotture a singolo filamento o SSB si verificano quando la radiazione danneggia le basi e fende la spina dorsale del DNA, mentre le rotture a doppio filamento, DSB, si sviluppano quando due SSB si verificano su filamenti di DNA opposti. Il primo passo della formazione di DSB è la fosforilazione dell'istone H2AX, che può essere visualizzata mediante colorazione in immunofluorescenza.

Per eseguire la colorazione in immunofluorescenza, aggiungere gli anticorpi primari a un campione fissato su un vetrino coprioggetti posto in una capsula di Petri. Gli anticorpi si legano alla proteina istonica fosforilata gamma-H2AX. Incubare il campione e lavarlo con PBS per rimuovere gli anticorpi non legati. Successivamente, aggiungi gli anticorpi secondari che trasportano i fluorofori, che riconoscono gli anticorpi primari e si legano ad essi. Aggiungere la quantità desiderata di colorante fluorescente DAPI per controcolorare i nuclei.

Montare delicatamente il vetrino coprioggetto su un vetrino con un mezzo di montaggio e osservare le cellule al micros