Rilevamento di ROS con colorazione DCFH-DA: misurazione dei ROS totali nelle linee cellulari di cancro del colon-retto
JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:50 min • April 30th, 2023
- Le specie reattive dell'ossigeno sono prodotte prevalentemente dai mitocondri quando gli elettroni fuoriescono dalla catena di trasporto degli elettroni. Questi elettroni si combinano con l'ossigeno molecolare dando origine a varie specie reattive dell'ossigeno, o ROS. Nelle cellule tumorali c'è una sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno. Queste molecole di ROS altamente reattive possono danneggiare ossidativamente membrane, proteine e DNA all'interno della cellula.
L'aumento dei livelli di ROS danneggia il DNA portando all'attivazione di una via di segnalazione oncogenica che causa la progressione del cancro. Pertanto, è fondamentale rilevare i livelli di specie reattive dell'ossigeno prodotte dalle cellule tumorali.
Inizia prelevando cellule tumorali dal cancro del colon-retto umano in un terreno di coltura appropriato. Quindi, seminare queste cellule in una piastra multipozzetto e aggiungere la soluzione DCFH-DA. Incubare la piastra per la durata desiderata. Il DCFH-DA attraversa la membrana cellulare. Una volta all'interno della cellula, il DCFH-DA si converte in DCFH in presenza di un enzima esterasi cellulare. Inoltre, l'ossidazione del DCFH da parte delle specie reattive dell'ossigeno produce molecole fluorescenti verdi.
Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza. L'intensità della fluorescenza verde indica il livello di specie reattive dell'ossigeno nella cellula. Nel seguente protocollo, utilizziamo il colorante DCFH-DA per colorare le specie reattive dell'ossigeno nelle cellule tumorali del colon-retto.
- Per colorare le cellule, rimuovere il terreno contenente il farmaco e lavarle una volta con DMEM. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DCFH-DA in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il DCFH-DA dai pozzetti e lavarli due volte con DMEM e una volta con PBS.
Quindi, aggiungi 500 microlitri di PBS a ciascun pozzetto. Utilizzare il canale proteico fluorescente verde sul microscopio a fluorescenza per scattare immagini rappresentative delle cellule. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra su ghiaccio per cinque minuti e raccogliere i lisati cellulari in provette da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 21.130 x g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, trasferire 100 microlitri di surnatante in una piastra nera a 96 pozzetti. Utilizzare un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri per misurare la fluorescenza in ciascun pozzetto.
Successivamente, misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford trasferendo 1 microlitro di surnatante in una piastra trasparente a 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione per il saggio proteico. Utilizzare le concentrazioni proteiche per normalizzare le intensità di fluorescenza.
Panoramica
Questo studio analizza la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule del cancro del colon-retto e il loro ruolo nella progressione tumorale. La metodologia prevede la colorazione delle cellule tumorali con DCFH-DA per misurare i livelli di ROS mediante microscopia a fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sul cancro
- Stress ossidativo
Sfondo
- Le specie reattive dell'ossigeno sono prodotte principalmente dai mitocondri.
- La sovraproduzione di ROS è associata a danni al DNA e alla progressione del cancro.
- La rilevazione dei livelli di ROS è fondamentale per comprendere il comportamento delle cellule tumorali.
- DCFH-DA è una sonda fluorescente utilizzata per misurare i ROS nelle cellule.
Scopo dello studio
- Quantificare i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in cellule umane di cancro del colon-retto.
- Comprendere le implicazioni delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella progressione del cancro.
- Stabilire un metodo affidabile per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) mediante microscopia a fluorescenza.
Metodi Utilizzati
- Coltivare cellule umane di cancro del colon-retto in un mezzo appropriato.
- Colorare le cellule con DCFH-DA e incubare.
- Lavare le cellule e osservarle al microscopio a fluorescenza.
- Misurare l'intensità della fluorescenza per quantificare i livelli di ROS.
Risultati principali
- Un aumento della fluorescenza verde indica livelli più elevati di ROS.
- Le misurazioni della fluorescenza si correlano con la concentrazione proteica.
- Il metodo rileva efficacemente i ROS nelle cellule tumorali.
Conclusioni
- I livelli di ROS sono significativamente elevati nelle cellule del cancro del colon-retto.
- La colorazione con DCFH-DA è un metodo valido per valutare lo stress ossidativo.
- Comprendere la dinamica dei ROS può contribuire a definire strategie di trattamento del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il rilevamento quantitativo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) totali in linee cellulari di cancro del colon-retto consente la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione degli obiettivi nella scoperta oncologica. Il protocollo di colorazione con DCFH-DA fornisce una misurazione standardizzata e riproducibile dei ROS, sostenendo la previsione nei programmi di biologia del cancro in fase iniziale. Questa capacità orienta la selezione e la priorizzazione del portafoglio collegando lo stress ossidativo alla segnalazione oncogenica e alla progressione della malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dello stress ossidativo come fattore meccanicistico nei modelli di cellule tumorali.
- Consente la validazione funzionale di bersagli che modulano la produzione o la risposta ai ROS.
- Fornisce letture quantitative per l'analisi ipotetica dei percorsi metabolici.
- Semplifica la riduzione del rischio biologico collegando i livelli di ROS alla segnalazione oncogenica.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Stabilisce un saggio quantitativo validato per la rilevazione di ROS in linee cellulari aderenti.
- Fornisce output riproducibili basati sulla fluorescenza, adatti per lo screening di composti.
- Permette la standardizzazione e la normalizzazione del saggio mediante controlli della concentrazione proteica.
- Consente una valutazione affidabile di modulatori candidati dello stress ossidativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la quantificazione delle specie reattive dell'ossigeno a modelli rilevanti per il cancro del colon-retto.
- Supporta strategie traslazionali di biomarcatori collegando le specie reattive dell'ossigeno a fenotipi cellulari.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica delle vie dello stress ossidativo.
- Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio per terapie mirate al sistema redox.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di rilevamento delle ROS con DCFH-DA si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test di ipotesi solidi e analisi quantitativa dei percorsi nei modelli di cellule tumorali.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla riguardo al coinvolgimento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella trasduzione del segnale oncogenico.
- Screening: Fornisce output fluorescenti standardizzati e quantitativi per la prontezza del saggio.
- Analisi: Permette la normalizzazione delle misurazioni delle ROS rispetto al contenuto proteico, al fine di effettuare confronti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la quantificazione delle ROS a fenotipi cellulari rilevanti per la malattia nel cancro del colon-retto.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e scalabile per la misurazione dello stress ossidativo in diversi programmi di oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per la quantificazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli oncologici.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati terapeutici modulatori del sistema redox in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e analisi con lettore di piastre.
- Necessita dell'accesso a colture cellulari validate, reagenti di colorazione e saggi di quantificazione delle proteine.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le condizioni del saggio e i protocolli di normalizzazione.
- Adattabile a diversi modelli di cellule aderenti, previa ottimizzazione adeguata.
- Dipende da una corretta normalizzazione rispetto al contenuto proteico per il confronto quantitativo.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026