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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:50 min. • April 30th, 2023
- Le specie reattive dell'ossigeno sono prodotte prevalentemente dai mitocondri quando gli elettroni fuoriescono dalla catena di trasporto degli elettroni. Questi elettroni si combinano con l'ossigeno molecolare dando origine a varie specie reattive dell'ossigeno, o ROS. Nelle cellule tumorali c'è una sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno. Queste molecole di ROS altamente reattive possono danneggiare ossidativamente membrane, proteine e DNA all'interno della cellula.
L'aumento dei livelli di ROS danneggia il DNA portando all'attivazione di una via di segnalazione oncogenica che causa la progressione del cancro. Pertanto, è fondamentale rilevare i livelli di specie reattive dell'ossigeno prodotte dalle cellule tumorali.
Inizia prelevando cellule tumorali dal cancro del colon-retto umano in un terreno di coltura appropriato. Quindi, seminare queste cellule in una piastra multipozzetto e aggiungere la soluzione DCFH-DA. Incubare la piastra per la durata desiderata. Il DCFH-DA attraversa la membrana cellulare. Una volta all'interno della cellula, il DCFH-DA si converte in DCFH in presenza di un enzima esterasi cellulare. Inoltre, l'ossidazione del DCFH da parte delle specie reattive dell'ossigeno produce molecole fluorescenti verdi.
Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza. L'intensità della fluorescenza verde indica il livello di specie reattive dell'ossigeno nella cellula. Nel seguente protocollo, utilizziamo il colorante DCFH-DA per colorare le specie reattive dell'ossigeno nelle cellule tumorali del colon-retto.
- Per colorare le cellule, rimuovere il terreno contenente il farmaco e lavarle una volta con DMEM. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DCFH-DA in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il DCFH-DA dai pozzetti e lavarli due volte con DMEM e una volta con PBS.
Quindi, aggiungi 500 microlitri di PBS a ciascun pozzetto. Utilizzare il canale proteico fluorescente verde sul microscopio a fluorescenza per scattare immagini rappresentative delle cellule. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra su ghiaccio per cinque minuti e raccogliere i lisati cellulari in provette da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 21.130 x g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, trasferire 100 microlitri di surnatante in una piastra nera a 96 pozzetti. Utilizzare un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri per misurare la fluorescenza in ciascun pozzetto.
Successivamente, misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford trasferendo 1 microlitro di surnatante in una piastra trasparente a 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione per il saggio proteico. Utilizzare le concentrazioni proteiche per normalizzare le intensità di fluorescenza.