Estrazione di miRNA circolanti: un metodo per isolare i miRNA da campioni di plasma tramite estrazione organica e arricchimento di piccoli RNA

- I microRNA o miRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica degradando l'mRNA o bloccando la loro traduzione in proteine funzionali. I miRNA circolanti sono potenziali biomarcatori del cancro e possono essere estratti dai fluidi corporei come il plasma. Per iniziare, mescolare il plasma con una soluzione denaturante che contemporaneamente omogeneizza il campione e inibisce le ribonucleasi che degradano l'RNA.

Trattare con fenolo-cloroformio acido e centrifugare per separare il campione in due fasi, una fase organica inferiore contenente DNA e proteine e una fase acquosa superiore contenente RNA. Recuperare la fase acquosa. Aggiungere etanolo assoluto per far precipitare l'RNA dalla soluzione.

Portare la concentrazione di etanolo del campione al 25% per impostare una condizione iniziale che favorisca una grande separazione dell'RNA. Trasferire la miscela in una cartuccia filtrante preassemblata e centrifugare. Gli RNA più grandi si immobilizzano selettivamente sul filtro, mentre i miRNA più piccoli si raccolgono nel filtrato.

Successivamente, aumentare la concentrazione di etanolo al 55% per favorire l'isolamento dei miRNA. Trasferire il filtrato in una nuova cartuccia filtrante e centrifugare per intrappolare i miRNA. Posizionare la cartuccia su una provetta di raccolta e aggiungere un tampone di eluizione adatto. Centrifugare per eluire i miRNA nella provetta. Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento di miRNA circolanti dal plasma di pazienti con cancro del colon-retto.

Per iniziare, trasferire 400 microlitri di campione di plasma in una provetta da 2 millilitri priva di RNasi. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione denaturante al tubo. Aggiungere 4 microlitri di spike-in da 1 nanomolare.

Dopo aver mescolato la soluzione, aggiungere 800 microlitri di fenolo-cloroformio acido. Agitare la soluzione per 60 secondi e centrifugare alla massima velocità per 15 minuti. Quindi, trasferire il lisato contenuto nella fase acquosa superiore in una provetta pulita, facendo attenzione a non disturbare l'interfase.

Misurare il volume della fase acquosa recuperata e aggiungere 1/3 del volume di etanolo al lisato. Quindi, inserire una cartuccia filtrante in una nuova provetta di raccolta. Trasferire fino a 700 microlitri della miscela di etanolo lisato nella cartuccia filtrante. Centrifugare la cartuccia del filtro per 30 secondi a 10.000 x g.

Quindi, misurare il volume totale del flusso. Quindi, aggiungere 2/3 del volume di etanolo al filtrato e mescolare bene. Inserire una seconda cartuccia filtrante in una nuova provetta di raccolta. Quindi, trasferire fino a 700 microlitri di campione nella cartuccia e centrifugare a 10.000 x g per 30 secondi prima di scartare il flusso.

Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio microRNA alla cartuccia filtrante e centrifugarla con una provetta di raccolta a 10.000 x g per 15 secondi. Scartare il flusso e reinserire la cartuccia del filtro nello stesso tubo.

Successivamente, spostare la cartuccia del filtro in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di eluizione preriscaldata alla cartuccia. Centrifugare la cartuccia del filtro a 10.000 x g per 30 secondi per recuperare i microRNA.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).