Etichettatura delle cellule organoidi di organoidi CRC: un metodo per generare cellule organoidi di cancro colorettale trasdotte da lentivirus GFP

- Gli organoidi sono costrutti cellulari tridimensionali in vitro che si auto-organizzano per imitare le caratteristiche chiave del tessuto del suo organo di origine. Per iniziare l'etichettatura, trattare gli organoidi raccolti con un cocktail di enzimi proteolitici e collagenolitici per dissociare le cellule in sospensione. Centrifuga per separare le cellule dal surnatante contenente enzimi. Scartare il surnatante. Sciogliere il pellet cellulare utilizzando un terreno contenente vettori lentivirali. Questi virus ricombinanti trasportano la sequenza codificante per una proteina fluorescente verde o GFP.

I virus si fondono con le cellule e rilasciano il loro materiale genetico e alcuni enzimi virali nel citoplasma. La trascrittasi inversa virale sintetizza il DNA virale complementare che si muove nel nucleo dell'ospite. L'integrasi virale aiuta a incorporare il DNA virale contenente la sequenza GFP nel genoma dell'ospite. Coltiva queste cellule trasdotte in una matrice extracellulare o in una piastra di coltura rivestita di ECM. Aspirare il terreno e centrifugare per raccogliere eventuali cellule non attaccate. Risospendere le cellule in un ECM aggiuntivo.

Sovrapporre la sospension