Etichettatura delle cellule organoidi di organoidi CRC: un metodo per generare cellule organoidi di cancro colorettale trasdotte da lentivirus GFP

- Gli organoidi sono costrutti cellulari tridimensionali in vitro che si auto-organizzano per imitare le caratteristiche chiave del tessuto del suo organo di origine. Per iniziare l'etichettatura, trattare gli organoidi raccolti con un cocktail di enzimi proteolitici e collagenolitici per dissociare le cellule in sospensione. Centrifuga per separare le cellule dal surnatante contenente enzimi. Scartare il surnatante. Sciogliere il pellet cellulare utilizzando un terreno contenente vettori lentivirali. Questi virus ricombinanti trasportano la sequenza codificante per una proteina fluorescente verde o GFP.

I virus si fondono con le cellule e rilasciano il loro materiale genetico e alcuni enzimi virali nel citoplasma. La trascrittasi inversa virale sintetizza il DNA virale complementare che si muove nel nucleo dell'ospite. L'integrasi virale aiuta a incorporare il DNA virale contenente la sequenza GFP nel genoma dell'ospite. Coltiva queste cellule trasdotte in una matrice extracellulare o in una piastra di coltura rivestita di ECM. Aspirare il terreno e centrifugare per raccogliere eventuali cellule non attaccate. Risospendere le cellule in un ECM aggiuntivo.

Sovrapporre la sospensione sulla coltura aderente per promuovere la vitalità cellulare. Una volta che la matrice si è solidificata, aggiungere il terreno di coltura e incubare per facilitare la formazione degli organoidi. Osservare la coltura al microscopio a fluorescenza. Le cellule trasdotte sintetizzano proteine fluorescenti verdi. Gli organoidi formati da queste cellule mostrano positività alla GFP. Il seguente protocollo dimostra la trasduzione lentivirale della GFP in cellule organoidi di cancro colorettale derivate da pazienti.

- Dopo 7-10 giorni di coltura, staccare meccanicamente gli organoidi con un raschietto cellulare sterile e trasferire gli organoidi in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la loro centrifugazione. Quindi, risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS picchiettando delicatamente per un'altra centrifugazione. Per dissociare gli organoidi del cancro del colon-retto, aggiungere 500 microlitri di soluzione enzimatica proteolitica e collagenolitica alle provette e mescolare picchiettando delicatamente.

Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 500 microlitri di terreno integrato con l'1% di FBS alle cellule e pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare più volte per rompere gli organoidi.

- Il pipettaggio delicato degli organoidi di CRC umano durante il passaggio è fondamentale per mantenere intatta la formazione di sferoidi in coltura.

- Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri di stock di lentivirus GFP 5x e 400 microlitri di terreno di coltura di organoidi per il cancro del colon-retto fresco.

- È essenziale infettare gli organoidi CRC umani con un alto titolo di lentivirus GFP, in particolare per ottenere un'efficienza di infezione quasi del 100%.

- Regolare il volume in ciascuna provetta per ottenere una 5 volte 10 alla quinta cellula tumorale dissociata per 500 microlitri di media concentrazione e posizionare 500 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale, come dimostrato. Dopo 18 ore nell'incubatore per colture cellulari, trasferire i surnatanti contenenti cellule galleggianti in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la centrifugazione, seguita dalla risospensione dei pellet in 70 microlitri di matrice extracellulare artificiale per provetta su ghiaccio.

Per migliorare la vitalità delle cellule tumorali del colon-retto, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente cellule tumorali sugli organoidi tumorali nella piastra a 12 pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti. Quando il rivestimento della matrice extracellulare artificiale si è solidificato, alimentare le colture con 1 millilitro di terreno di coltura per organoidi di CRC fresco integrato con FCS all'1% e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Quindi, osservare le cellule infette mediante microscopia a fluorescenza per confermare una positività alla GFP quasi del 100% e riportare le cellule nell'incubatore per altri 4-6 giorni.