JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 5:19 min • April 30th, 2023
- Iniziare prendendo un topo mutante condizionale anestetizzato con un genoma modificato che trasporta specifiche sequenze di riconoscimento dell'enzima Cre-ricombinasi chiamate inserti LoxP che fiancheggiano il gene oncosoppressore desiderato da mutare. Esporre chirurgicamente la cavità addominale. Individuare il colon distale e bloccarne la parte superiore. Inserire per via transanale un tubo di grado medico e farlo avanzare nel colon distale. Sciacquare il colon con soluzione fisiologica per rimuovere qualsiasi materia fecale. Sostituire il tubo. Bloccare la regione inferiore del colon per la segmentazione. Gonfiare il segmento utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare adatta. Questo perfora la barriera mucosa e aumenta l'accessibilità delle cellule della cripta intestinale. Svuotare la soluzione di dissociazione.
Quindi, iniettare una sospensione adenovirale nel segmento del colon. Questi vettori virali ingegnerizzati codificano per gli enzimi Cre-ricombinasi. Il virus entra nella cellula, rilascia il suo DNA nel nucleo ed esprime gli enzimi. Le proteine riconoscono gli inserti di LoxP nel genoma dell'ospite e catalizzano la ricombinazione sito-specifica, inattivando così il gene oncosoppressore. Questa mutazione con perdita di funzione promuove la progressione del cancro. Sutura l'incisione e lascia che il topo si riprenda. Monitorare per osservare la crescita di tumori colorettali isolati. Il seguente protocollo mostra la generazione di un modello murino di cancro del colon-retto mediante infezione segmentaria da adeno-cre.
- Inizia posizionando un topo anestetizzato in posizione supina e applica un unguento sugli occhi dell'animale. Fissare il mouse in una posizione sicura e quindi confermare il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi. Praticare un'incisione della linea mediana di circa 15 millimetri nella pelle del basso addome. Quindi, usa una pinza per afferrare la muscolatura della parete addominale e incidi con cura il muscolo con le forbici per aprire la cavità addominale. Dopo aver identificato il colon distale, stringere con cura il tessuto con una pinza delicata a circa 15 millimetri prossimalmente all'ano.
Successivamente, inserire un tubo flessibile in teflon per via transanale, facendo avanzare con cautela il tubo fino a raggiungere l'occlusione luminale e incannulare il tubo con una cannula calibro 30. Collegare una siringa standard da 1 millilitro alla cannula e sciacquare il colon con diversi millilitri di soluzione fisiologica normale fino a quando tutta la materia fecale non è stata evacuata. Una volta che il colon distale è vuoto, sostituire il tubo salino con un nuovo tubo in teflon e utilizzare un secondo morsetto per occludere il colon a circa 3 millimetri distalmente dal primo morsetto.
Utilizzando una seconda siringa da 1 millilitro dotata di una cannula calibro 30, iniettare con cautela da 50 a 80 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,25% nel segmento del colon bloccato. Il colon dovrebbe gonfiarsi abbastanza da rompere la barriera mucosa senza perforare il segmento di tessuto bloccato. Dopo 10 minuti, rimuovere il morsetto distale. Quindi, rimuovere la provetta di tripsina e sciacquare il colon distale con 500 microlitri di soluzione fisiologica.
Dopo aver inserito un nuovo tubo di teflon, bloccare nuovamente il colon e gonfiare il tessuto con 50-80 microlitri di soluzione adenovirale. Dopo 30 minuti, rimuovere le pinze e il tubo e chiudere la parete addominale con suture da corsa 6-0 rapidamente assorbibili. Chiudere la pelle con clip per ferite chirurgiche e monitorare l'animale su un termoforo fino a quando non si è completamente ripreso.
Per monitorare la crescita del tumore tramite colonscopia, posizionare l'animale anestetizzato portatore di tumore in posizione supina su un termoforo e inserire transanalmente l'endoscopio nel tratto intestinale. Inufflare delicatamente l'aria sotto controllo visivo per distendere il colon. Quindi, spingere con cautela l'endoscopio in avanti fino a quando la lesione della mucosa non può essere identificata nel colon distale, salvando ogni immagine endoscopica man mano che viene acquisita per una valutazione successiva. Quando tutte le immagini sono state ottenute, rimuovere lentamente l'endoscopio e posizionare il mouse su un termoforo a 38 gradi Celsius fino a quando non si riprende completamente.