Saggio della fosfatasi nelle cellule CRC: un metodo per esaminare lo stato di fosforilazione della proteina tau nelle cellule tumorali del colon-retto

- La proteina tau si localizza perifericamente al nucleolo nelle cellule tumorali del colon-retto e aiuta a mantenere la struttura nucleolare. Per lo più, queste cellule esprimono la proteina tau iperfosforilata, che si traduce in resistenza ai farmaci. Pertanto, analizziamo i livelli di fosforilazione della tau eseguendo un saggio della fosfatasi.

Inizia prendendo il lisato cellulare contenente proteine totali da cellule tumorali del colon-retto umano in due fiale etichettate come test e controllo. Trattare il campione di prova con l'enzima fosfatasi alcalina. La fosfatasi alcalina rimuove i gruppi fosfato dalla tau, mentre la fiala di controllo trattiene la proteina tau fosforilata.

Successivamente, eseguire sia il campione che la tau di controllo su un gel di poliacrilammide per separare le proteine. La tau fosforilata si muove più lentamente sul gel rispetto alla proteina tau non fosforilata. Elettrocolorare il campione proteico su una membrana adatta e aggiungere anticorpi primari corrispondenti sia alla tau fosforilata che a quella normale.

Incubare il blot durante la notte. Trattare il blot con un anticorpo secondario coniugato con un enzima reporter che si lega alla regione