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0 visualizzazioni • 4:28 min • April 30th, 2023
- La tau è una proteina associata ai microtubuli coinvolta nella stabilizzazione e nell'assemblaggio dei microtubuli. Molte cellule tumorali esprimono la proteina tau iperfosforilata, che non riesce a mantenere un legame ben organizzato con i microtubuli. Per studiare l'interazione tra la proteina tau e i microtubuli, aggiungere lisato di cellule tumorali contenente proteina tau e una soluzione di lavoro per microtubuli in un tubo per microfuge.
Le proteine tau non fosforilate presenti nel lisato cellulare si legano ai microtubuli. Ora, aggiungi la quantità desiderata di tampone PEM nella provetta per stabilizzare l'attività della tubulina, una proteina che polimerizza in filamenti per formare microtubuli. Incubare la miscela per la durata desiderata.
Centrifugare la miscela per pellettare la proteina legata ai microtubuli. La proteina non legata rimane nel surnatante. Trasferire il surnatante in una provetta nuova e rimettere in sospensione il pellet in un tampone adatto. Aggiungere un tampone di caricamento in gel alla sospensione del pellet risospeso ed eseguire i campioni su un gel di poliacrilammide per separare le proteine legate ai microtubuli ed elettroblot su una membrana adatta.
Aggiungere anticorpi adatti e sviluppare il blot utilizzando un substrato di chemiluminescenza per identificare le proteine tau legate. Nel seguente protocollo, eseguiremo il saggio di legame dei microtubuli per identificare le proteine legate ai microtubuli.
- Dopo aver preparato i campioni freschi, incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Ultracentrifugare i campioni a 100.000 x g e 25 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi, trasferire 120 microlitri di ciascun surnatante contenente tau non legata in provette separate pulite ed etichettate. Aggiungere 120 microlitri di tampone campione 5X al pellet che contiene tau legata.
Dopo aver miscelato accuratamente mediante vortice e pipettaggio, trasferire la miscela in provette pulite etichettate. Dopo aver preparato campioni con concentrazione proteica equivalente, aggiungere un tampone fresco 4X SDS contenente 400 millimolari di DTT. Utilizzare un blocco termico per incubare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti.
Agitare i campioni, quindi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Caricare 13 microlitri di campione per pozzetto e la scala del peso molecolare su un gel di poliacrilammide al 10%. Collegare gli elettrodi positivo e negativo del sistema di elettroforesi a una fonte di alimentazione, quindi impostare la tensione a 70 volt per 20 minuti.
Dopodiché, aumentare a 125 volt e far funzionare il gel per circa 70-120 minuti fino a quando i campioni e la scala proteica raggiungono la fine del gel. Utilizzare il sistema di elettroblotting a umido per trasferire il gel su una membrana di fluoruro di polivinilidene a 100 volt per circa 100 minuti. Incubare la membrana per tamponare con albumina sierica bovina al 4% per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, incubare per una notte in soluzione di anticorpi primari a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo, lavare la macchia quattro volte con PBST con ogni lavaggio della durata di sette minuti. Incubare il blot lavato in una soluzione di anticorpi secondari pertinente per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare con PBST per sette minuti ripetendo il lavaggio per un totale di quattro volte. Sviluppare il blot utilizzando un kit di chemiluminescenza. Coprire con pellicola trasparente e acquisire le immagini utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza.