Saggio di legame dei microtubuli nelle cellule CRC: un metodo per esaminare la proteina tau legante i microtubuli nelle cellule di cancro del colon-retto

- La tau è una proteina associata ai microtubuli coinvolta nella stabilizzazione e nell'assemblaggio dei microtubuli. Molte cellule tumorali esprimono la proteina tau iperfosforilata, che non riesce a mantenere un legame ben organizzato con i microtubuli. Per studiare l'interazione tra la proteina tau e i microtubuli, aggiungere lisato di cellule tumorali contenente proteina tau e una soluzione di lavoro per microtubuli in un tubo per microfuge.

Le proteine tau non fosforilate presenti nel lisato cellulare si legano ai microtubuli. Ora, aggiungi la quantità desiderata di tampone PEM nella provetta per stabilizzare l'attività della tubulina, una proteina che polimerizza in filamenti per formare microtubuli. Incubare la miscela per la durata desiderata.

Centrifugare la miscela per pellettare la proteina legata ai microtubuli. La proteina non legata rimane nel surnatante. Trasferire il surnatante in una provetta nuova e rimettere in sospensione il pellet in un tampone adatto. Aggiungere un tampone di caricamento in gel alla sospensione del pellet risospeso ed eseguire i campioni su un gel di poliacrilammide per separare le proteine legate ai microtubuli ed elettroblot su una membrana