Isolamento CTC da un campione di sangue intero: un metodo per ottenere CTC da un modello di cancro colorettale murino

- Le cellule tumorali circolanti, o CTC, sono le cellule tumorali che derivano dal tumore primario ed entrano nella circolazione sanguigna. La maggior parte delle CTC può sopravvivere nel flusso sanguigno senza attaccarsi alla superficie; Pertanto, possiamo rilevarli direttamente dal sangue della maggior parte dei pazienti oncologici.

Le CTC nel sangue possono indicare la diffusione del tumore all'interno del corpo, quindi identificarle aiuta a comprendere la progressione del cancro. Inizia prendendo un modello murino di cancro del colon-retto anestetizzato e ottieni il sangue mediante puntura cardiaca. Trasferire il sangue in una provetta conica contenente un mezzo a gradiente di densità e centrifugare per separare i componenti del sangue.

Scartare lo strato più superficiale contenente plasma e raccogliere la frazione di cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, presente all'interfaccia in una provetta separata. Successivamente, aggiungere l'anticorpo anti-EpCAM alle cellule PBMC e osservare al microscopio a fluorescenza. Le CTC circolanti esprimono un marcatore cellulare noto come molecola di adesione cellulare epiteliale o EpCAM. Pertanto, gli anticorpi anti-EpCAM possono aiutare a identificare le CTC positive per EpCAM.

Raccogli i CTC e conservali per ulteriori analisi a valle. Nel seguente protocollo, identificheremo le CTC che esprimono EpCAM dalla frazione di cellule mononucleate periferiche del sangue del modello murino di cancro del colon-retto.

- Per isolare le cellule tumorali circolanti all'endpoint sperimentale appropriato, riempire provette coniche da 15 millilitri con 5 millilitri di terreno a gradiente di densità per provetta e trasferire con cura i campioni di sangue intero raccolti da animali portatori di tumore sugli strati del gradiente di densità.

Separare le cellule mediante centrifugazione e recuperare con cura l'interfaccia contenente le celle mononucleate. Pipettare le cellule mononucleate in una nuova provetta da 15 millilitri per una seconda centrifugazione, seguita da due lavaggi in PBS. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS integrato con EDTA e aggiungere quattro microlitri di anticorpi anti-EpCAM a ciascun campione per un'incubazione di 20 minuti su ghiaccio al buio.

Successivamente, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio di circa 1 centimetro in una piastra di Petri sterile da 6 centimetri per campione e aggiungere 700 microlitri di tampone di prelievo a ciascun cerchio, seguiti da 50 microlitri di sospensione cellulare. Utilizzare un microscopio per controllare la densità delle cellule e lasciare che i campioni si depositino per circa cinque minuti. Quindi, esaminare la goccia di cellule per la positività all'EpCAM e utilizzare il micromanipolatore per trasferire le cellule di interesse in 50 microlitri del tampone appropriato per la successiva analisi a valle prevista.