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- I modelli organotipici 3D del cancro del colon-retto sono colture in vitro ingegnerizzate per imitare i microambienti tumorali in vivo. La coltura contiene spesso cellule stromali, come i fibroblasti, co-coltivate con cellule epiteliali del cancro del colon-retto, in un microambiente di matrice extracellulare adatto.
Nelle colture consolidate, le cellule tumorali con potenziale metastatico invadono la matrice extracellulare. Per isolare queste cellule invasori, in primo luogo, trattare il modello organotipico con formaldeide per fissare le cellule e la matrice extracellulare. Incubare con alcol per disidratare il campione.
Quindi, incorporare la cera di paraffina liquida per generare un blocco di tessuto. Utilizzare un ultramicrotomo per ottenere sezioni tagliate sottilmente. Montare le sezioni su un apposito vetrino.
Aggiungi lo xilene per deparaffinare le sezioni. In sequenza, incubare le sezioni in concentrazioni decrescenti di etanolo per reidratare i campioni.
Trattare con Cresyl Violet per colorare e differenziare le cellule tumorali del colon-retto dal microambiente. Posizionare il vetrino colorato rivolto verso il basso sul tavolino del microscopio. Utilizzando un software appropriato, identificare le cellule da microdissezionare e delineare i confini. Spara il laser per tagliare la sezione evidenziata e raccogliere la parte microsezionata.
Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento di cellule tumorali del colon-retto da un modello di co-coltura organotipica 3D mediante microdissezione laser.
- Togliete l'intero organotipico, compreso il foglio di nylon, dal pozzetto e adagiatelo su pellicola trasparente. Dividere in due l'organotipico e il foglio di nylon utilizzando un bisturi monouso pulito e fissare entrambe le metà in formaldeide per 24 ore a temperatura ambiente. Sostituire la formaldeide con etanolo al 70% dopo 24 ore e lasciare agire per una notte prima dell'inclusione nella paraffina, del sezionamento e della colorazione.
Per eseguire la microdissezione laser, sezionare prima l'organotipico a uno spessore di 10 micron su vetrini montati su membrana. Dopo aver trattato le sezioni come descritto nel protocollo di testo, prepararsi a condurre la microdissezione laser utilizzando la piattaforma scelta.
Posizionare il vetrino con la sezione colorata da microsezionare a faccia in giù sul tavolino del microscopio. Montare una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri nella cassetta di raccolta e aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi cellulare al tappo in cui si raccoglierà il tessuto microsezionato. In visione diretta, utilizzare il joystick per identificare il tessuto di interesse e, utilizzando l'interfaccia software, annotare la sezione organica colorata, evidenziando le cellule da microdissezionare sul fronte dell'invasione tumorale.
Istruire il laser a sparare, che dovrebbe sia ritagliare la sezione evidenziata che spingere il tessuto microsezionato nel tappo della provetta della microcentrifuga. Procedere all'elaborazione dei campioni con un metodo appropriato per estrarre l'analita di interesse.